PCR分子实验室污染分析及解决对策

PCR分子实验室污染分析及解决对策聚合酶链反应（PCR）是一种体外核酸扩增技术，它具有特异、敏感、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，能在几个小时内完成从一块组织、一根毛发，甚至一个细胞中扩增出足量的目的产物供分析研究和检测鉴定，所以，近年来PCR技术被广泛应用于人和动物的多种传染病早期诊断和食品/饲料中特定成分的检测。PCR反应虽然具有较强扩增能力和极高的灵敏性等优点，但是也存在一个令人头痛的问题——易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的结果。如果形成气溶胶污染扩散，则可引起整个PCR实验室的污染，处理起来非常棘手，严重的甚至要关闭实验室。一、污染种类PCR实验室污染主要是下面三个方面：（一）标本间交叉污染：主要是在采（取）样的过程中，由于取样工具之间的交叉造成污染；或者在核酸提取的过程中，由于移液器、离心管等使用不当导致的污染。（二）PCR试剂的污染：主要是在PCR试剂配制过程中，由于移液器、容器、阴性对照及其它试剂被核酸模板或阳性对照污染。（三）PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大（一般为1013copies/mL），远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染。二、污染的监测一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染，是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。1、对照试验①阴性质控对照a)提取空白对照：核酸提取过程中不加样品的空白管；b)PCR试剂对照：不含DNA/cDNA模板的PCR扩增反应液试剂；c)阴性目标DNA对照：即为内源基因对照，是不含外源目标核酸序列片段的模板。可使用阴性标准物质，并与测试样品等同处理进行核酸提取及PCR扩增。②阳性质控对照a)弱阳性对照：使用已知的弱阳性样品作为阳性质控样品，并与测试样品等同处理进行核酸提取及PCR扩增；b)阳性目标DNA对照：使用含有目标DNA/RNA序列片段的阳性标准物质和（或）质粒。2、重复性试验为了避免实验结果的偶然性，需要设置平行实验，必要时可以对所做实验在同样条件下进行足够次数的重复。三、防止污染的方法进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。（一）人员：转基因产品检测实验室的人员要按照严格的培训流程进行培训与考核，实验室操作人员应具备良好的分子生物学专业技术操作规范。（二）划分操作区：PCR分子实验室原则上分为四个单独的工作区域：试剂配制室、样品处理室、核酸扩增区和产物分析室。为避免交叉污染，进入各个工作区域必须严格遵循单一方向进行，即只能从试剂准备区→样品制备区→PCR扩增区→产物分析区。各实验区之间的试剂及样品传递应通过传递窗进行。不同的工作区域使用不同的工作服（例如不同的颜色）。任何一间的产物及器材不要拿到其他工作区，工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。四、实验操作注意事项尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：1.在检测过程中，所有试剂都要往自己的正前方放置，切不可从敞开口的试剂上方经过；2.穿戴一次性手套，若在操作过程中不慎溅上溶液，应立即更换手套；3.采（取）样品的工具和容器最好使用一次性的，如重复使用，应在使用前应于180℃的高温下干烤6小时以上或者于0.5%的次氯酸钠溶液中浸泡过夜；4.样品存放时要密封严实，以防外溢造成相互间的交叉污染；5.使用镊子夹用离心管或DNA吸附柱，不能直接用手拿取，注意不要碰触离心管内盖和吸附柱下端的开口处；6.在核酸提取时，可增加空白提取对照或阴性样本提取对照，对核酸提取过程和实验环境进行控制；7.操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，减小误差，增加反应的精确度；8.在加入模板时，应该按照“阴性对照-待测样品-阳性对照”的加样顺序，操作上应遵循“开管盖-加模板-盖管盖”的原则，保证管与管之间不会交叉污染；9.移液器污染也是一个值得注意的问题。由于操作不慎将样品或提取物吸入枪内或粘上吸头是一个严重的污染源，因而加样或吸取时要十分小心，吸时要慢，吸取尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染；10.实验室要注意通风透气，防止气溶胶集聚太多。气溶胶不仅会导致实验失败，而且也会损害操作人员身体健康，因此每次实验完毕都要及时清理实验台面，用0.5%次氯酸钠消毒后再打开紫外灯照射半小时。11.重复实验，验证结果，慎下结论。