-SOD的检测方法及评价和临床应用

SOD的检测方法及评价和临床应用讲授内容•SOD研究的概况•SOD的分类•SOD的理化特性•SOD的结构•SOD的活性影响因素•SOD的测定方法•SOD的临床应用SOD：超氧化物歧化酶•一类抗氧化防御体系中重要的金属酶•1938年Mann和Keilin首次从牛红细胞分离到一种蓝色铜蛋白•1969年美国学者McCord和Fridovich发现该金属蛋白酶是具有催化发生歧化作用，并且具有清除超氧阴离子的能力，因此称之为超氧化物歧化酶同一物质中同一价态的同一元素间发生的氧化还原反应（发生歧化的元素会部分升价、部分降价）。氧化还原反应的一种类型。又称自身氧化还原反应SOD的研究概况•具有抗炎、抗病毒、抗辐射、抗衰老等作用•大量研究表明，SOD活性低下可以看作是某些疾病的特征之一•在病毒性疾病、自身免疫性疾病、心肌缺血和缺血再灌流综合症、老年性白内障、心血管疾病、辐射病、癌和癌的放射治疗预防以及人类长寿等领域的研究中也己有突破性进展如肾病，高血压，恶性肿瘤患者体内的SOD下降。目前已作为临床检测的一个诊断指标，有很高的参考价值。SOD的研究概况•目前，SOD作为药用酶已经开始试用于治疗关节炎、红斑狼疮等疾病•也可作为化妆品的添加剂，具有抗衰老、祛斑，抗皱，防晒、抗炎等功效•国际生化委员会，美国联邦食品管理局称其为“抗衰因子”、“美容娇子”。•SOD还可以加入到牙膏、漱口水、含片等中，对预防口腔疾病有一定的疗效•保健食品有效成分（酸奶，啤酒)；抗氧化剂，抑制过氧化酶（水果，蔬菜保鲜）SOD的分类•根据活性中心结合的金属离子不同，SOD主要分为•①Cu／Zn—SOD，主要存在于真核细胞的细胞质中，广泛分布于动物的血、肝和菠菜叶、刺梨等生物体中•②Fe—SOD，主要存在于原核细胞和真核细胞的基质，分布于较原始的生物类群中SOD的分类•③Mn-SOD，主要存在原核细胞及少数植物细胞•Sa-OukKang等人最近又从链霉菌Streptomycesspp.和S.coelicotor中发现了两种新的SOD，一种是含镍酶即Ni-SOD，另一种是含铁和锌的酶即Fe/ZnSOD，它们均为四聚体，表观分子量分别是13KD和22KDSOD的理化特性Cu(I1)与四个组氨酸残基咪唑环上N原子配位形成变形的平面四方形结构，其轴向位置上还结合着一个水分子，Zn(Ⅱ)则与三个组氨酸和一个天冬氨酸配位形成畸变的四面体结构，cu(I1)与zn(II)之间通过共同连接一分子组氨酸而形成“咪唑桥”结构。SOD的活性影响因素•与SOD活性中心的氨基酸残基、金属离子及其配位环境、“咪唑桥”的变化有关•①SOD活性中心的精氨酸和组氨酸对SOD的催化活性具有极其重要的意义。这两个氨基酸离中心金属离子非常近，而且均带有正电荷，能诱导底物O·，进入活性中心，并可在催化过程中提供H+以加快歧化反应速度。如这两个氨基酸残基被破坏或修饰，SOD将会失活。SOD的活性影响因素•SOD中心金属离子的作用也不相同。对于Cu／Zn/SOD，Zn(I1)的作用一是调节咪唑基与cu的相互作用，二是稳定活性中心的结构。若除去酶分子中zn(I1)而保留原有环境中时cu(I1)，SOD仍有相当高的活性。cu(I1)与酶催化作用有关，起着传递电子的作用。若除去cu(I1)，则SOD将会失活，重新加入Cu(Ⅱ)后SOD的酶活性恢复。另一方面，Cu(Ⅱ)所处的环境对活性有重要影响。若以其它金属离子代替cu(II)，同时用cu(I1)代替zn(I1)，则酶失去全部活性SOD的活性影响因素•对“咪唑桥”配合物进行催化的研究表明，在催化过程中，“咪唑桥”在与铜相连的一侧的N原子迅速地发生了质子化和去质子化的变化，对酶的催化活性有重要影响。测定的生物样品•市面上能购买到测SOD的试剂盒，可以测定生物样品中血清（血浆），脑脊液，胸水，腹水，肾透析液，尿液，红细胞，白细胞，血小板，心肌培养细胞，肿瘤培养细胞，各种动植物组织细胞及亚细胞水平（线粒体，微粒体）中的SOD的活力.测定方法•极谱氧电极法•直接法电泳法•极谱法酶联免疫吸附技术•免疫法放射免疫法•化学发光免疫•间接法•化学发光原理是直接测定SOD催化反应的底物反应速度或产物生成速度通过某种能产生O·的系统，使O·进行另一个便于检测的反应，测定特征波长下的光吸收变化速率，计算SOD对这个反应的抑制程度从而间接定量SOD活性测定方法••间接方法肾上腺素法•羥胺法•化学方法Mccod法•NBT法•邻苯三酚法建立一个O2。。的产生体系，和一个被O2.。。，一氧化或还原的可检测体系。在SOD存在下，一部分O2。。被SOD歧化，因而O2。。的氧化或还原检测体系的反应就会受到抑制。根据反应受抑制程度，测定SOD的活性黄嘌呤氧化酶-细胞色素c还原法•黄嘌呤氧化酶•黄嘌呤O2..+尿酸•+•氧化型细胞色素C•还原型细胞色素C•（550nm)SOD方法评价•该法为最早建立的活性测定法，被认为是一种经典可靠的方法。•但该法灵敏度较低，易受反应底物不纯的影响。邻苯三酚法•原理：•在碱性条件下，邻苯三酚发生自氧化反应，并产生O2..，在SOD存在下，自氧化反应受到抑制方法评价•该法所用试剂和仪器比较普通，测试操作简便，灵敏度高，是目前应用最广泛的一种测试方法。但邻苯三酚法在测定时易受到一些杂质干扰，如无机盐(NH)2SO4、CuSO4等。而且直接用(NH)2SO4和VitC溶液代替SOD样品进行测定．邻苯三酚的自氧化率一样会受到抑制，从而造成假象。反应时间不易精确控制，其测定结果受环境及操作经验变化大，分析的重现性不十分理想临床应用•肝病的监测•高危妊娠的监测•肾病的监测•高血压的监测•神经系统病变的监测肝病患者血清MDA水平升高，SOD水平降低，表明此时机体内自由基生成与清除的动态失调。这种失平衡状态在体内越久组织细胞抗氧化防御保护功能越弱，肝损伤程度越重。表现为急性肝炎、慢性肝炎及肝硬化的血清SOD含量呈阶梯式下降，因此，临床上检测血清S0D水平变化，对临床判断肝细胞损伤程度，病情发展和评估预后上有一定的意义。通过检测肝胆结石患者的SOD含量发现，患者的值明显低于正常人，所以通过测定SOD可以间接了解体内自由基的产生和清除的平衡情况，对该病的预防及治疗有一定的作用。观测了正常妊娠、高危妊娠和对照组（健康育龄妇女）血液的SOD值，而前两组的SOD值均较对照组显著增高，而高危妊娠的SOD含量值低于正常妊娠，说明妊娠后体内脂质过氧化反应增强，自由基增多．为了保持氧化与抗氧化反应的平衡，清除大量自由基，体内SOD值相应地显著增高，对母体健康及胎儿发育内环境的稳定具有非常重要的意义。高危妊娠时，氧化与抗氧化能力可能在更高代谢水平上进行，因而其脂质过氧化作用较正常妊娠时增强，而抗氧化作用不仅没有增强，反而降低，从而导致胎盘功能受损.所以测定SOD值对高危妊娠的病理生理改变有一定的参考意义。检测尿毒症患者血液透析前后外周血SOD的比较：患者在血透析前SOD的含量为196.3±45.42u/ml,血透析后293.76±72.61u/ml,可能机制是肾功能不全病人体内积聚大量的FR，经血透后用调节系统反应性增强,血浆内SOD含量升高,所以根据体内SOD的动态变化可以了解肾功能的改变。SOD的检测可作为肾病综合症治疗监测的指标之一研究发现高血压患者血浆SOD显著低于正常对照组，而且高血压的分期不同,其血浆SOD的值也不同；I＞II＞III。通过测定血浆SOD的变化可以防止高血压的发病以及判断高血压病情的发展程度指标之一。帕金森病患者的临床血浆和红细胞中的超氧化物歧化酶，受到帕金森病病程的影响，帕金森病晚期患者血浆和红细胞中的超氧化物歧化酶活性显著降低。有研究认为阿尔茨海默病和帕金森病患者一样，超氧化物歧化酶活性均低于正常，提示超氧化物歧化酶活性降低，可能加剧阿尔茨海默病各种发病因素造成的损害，在其发病过程中起协同作用。研究发现铜锌超氧化物歧化酶基因突变所致的家族性肌萎缩侧索硬化症患者，其红细胞内的铜锌超氧化物歧化酶活性下降约50％-60％，而突变基因携带者(即症状前患者)红细胞内铜锌超氧化物歧化酶活性也明显降低。