叶绿素荧光分析技术与应用

叶绿素荧光分析技术与应用1931年，Kautsky和Hirsch第一次用肉眼发现叶绿素荧光动力学现象（Kautskyeffect）距今已有80多年，但把叶绿素荧光动力学作为一种技术应用于光合作用的研究中则是近20年的事。叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作用，与“表观性”的气体交换指标相比，叶绿素荧光参数更具有反映“内在性”特点。因此，叶绿素荧光动力学技术被称为测定叶片光合功能快速、无损的探针，并广泛应用于植物生理学、生态学和农业科学研究中。基本概念：绿色植物或含叶绿素的部分组织在黑暗中适应片刻或用近红外光预照射，然后在可见光下激发，并用荧光仪检测，会发现植物绿色组织发出一种微弱的暗红色的、强度随时间不断变化的荧光信号，这个过程称为叶绿素a荧光诱导动力学，简称为叶绿素荧光动力学。荧光来源：由于叶绿素分子吸收的光能有一部分消耗于分子内部振动上，辐射出的能量就小，根据波长与分子能量成反比的规律(E=hv2)，反射光的波长比入射光的波长要长一些。所以叶绿素溶液在入射光下呈绿色，而在反射光下呈红色。绝大部分植物体内叶绿素荧光来自PSII的天线色素系统，而PSI色素系统基本不产生荧光。荧光来源：叶绿素分子吸收量子后，由最稳定的、最低能量的基态（常态）提高到一个不稳定的、高能状态的激发态。由于激发态不稳定，迅速向较低能态转变，能量有的以热量的形式散失，有的以光形式散失。从第一单线态回到基态所发射的光就成为荧光。荧光的寿命很短，约为10-8－10-9s。光合电子传递的”Z图”激发能光化学反应形成同化力热耗散荧光荧光测量基础：植物叶片所吸收的光能有3个走向：光合驱动、热能、叶绿素荧光。3个过程之间存在竞争，其中任何一个效率的增加都将造成另外两个产量的下降。测量叶绿素荧光产量，可以获得光化学过程与热耗散效率的变化信息。CO2固定光呼吸Mehler反应N代谢荧光是研究光能分配的探针叶绿素荧光：植物吸收的一小部分光重新以光的形式发射出来P+D+F=1F=1-P-D光化学的和耗散性的荧光淬灭(F)(D)(P)活体叶绿素荧光是光合作用的有效探针•活体状态下，叶绿素荧光几乎全部来源于PSII的Chla（包括天线Chla），活体叶绿素荧光提供的快速信息仅仅反映了PSII对激发能的利用和耗散情况•光合作用过程的各个步骤密切偶联，因此任何一步的变化都会影响到PSII从而引起荧光变化，也就是说通过叶绿素荧光几乎可以探测所有光合作用过程的变化尽管叶绿素荧光产量仅占叶片吸收光能问题的1－2%，但测量却非常简单。荧光光谱不同于吸收光谱，其波长更长，因此荧光测量可以通过把叶片经过给定波长的光线的照射，同时测量发射光中波长较长的部分光线的量来实现。叶绿素荧光测量是相对的，因为光线不可避免会有损失，因此，所有分析必须把数据进行标准化处理，包括进一步计算的许多参数。将绿色植物或含叶绿素的部分组织，如叶片、芽、嫩枝条、茎或单细胞藻类悬液放在暗中适应片别，或用近红外光预照射，然后在可见光下激发，并用荧光计检测，结果就会发现植物绿色组织会发出一种微弱的暗红色强度随时间不断变化的荧光信号，这过程称为植物体内叶绿素a荧光诱导动力学，简称为叶绿素荧光动力学。绝大部分是来自叶绿体光系统II(PSII)的天线色素蛋白复合体中的叶绿素a分子，荧光发射波长范围约在650－780nm，荧光发射峰在685nm和735nm，其荧光激发光谱与叶绿体的吸收光谱近似，荧光激发峰在438nm与480nm左右。根据现在国际上的统一命名，可把荧光诱导曲线划分为：O(原点)→I(偏转)→D(小坑)或pl(台阶)→P(最高峰)→S(半稳态)→M(次峰)→T(终点)这几个相(phase)。有时在O和I之间还可辨认出一个扔点称为J相。其中O→P相为荧光快速上升阶段(1－2s)，从P→T为荧光慢速下降(猝灭)阶段(4－5s），在此阶段，往往出现复杂的情况，有时没有M峰，有时出现几个渐次降低的峰，因叶片的生理状态不同而异。一般而言，遭受环境胁迫的叶片M峰消失，而生理状态良好的叶片往往在P峰之后有几个峰出现。这可能反映了同化力形成和使用之间从不平衡到平衡的一个快速的调节过程。叶绿素荧光诱导动力学OIDPSMT曲线经暗适应的绿色植物样品突然受到可见光照射时，体内叶绿素分子可在纳秒(ns)级时间内发出一定强度的荧光，此瞬时的荧光诱导相位称为初相或“O”相，此时的荧光称为固定荧光(Fo)，然后荧光强度增加的速度减慢，因而在Fo处形成拐点，接着以毫秒级速度形成一个缓台阶，称为“I”相和“D”相，数秒后荧光强度可达最高点，称为“P”峰。若所用激发光强度达到或超过被测样品光反应的光饱和点时，P峰即趋于或等于最大荧光(Fm)。荧光强度超过Fo那一部分的荧光称为可变荧光(Fv)。在P峰之后，植物荧光通常经1－2次阻尼振荡(称较大峰“M1”和“M2”)，才降到接近Fo的稳定的“T”相终水平。荧光强度下降的过程现称为荧光猝灭。根据植物材料和暗适应时间的不同，上述荧光诱导动力学过程要延续3—6分钟左右。叶绿素荧光动力学的测量可采用调制式与非调制式两种不同方法:非调制式荧光计的结构比较简单，它仅需要一个强连续光源，此光源既作为激发光，又作为测量光，但是为了能够捕捉到植物荧光信号上升前沿中的拐点，要求整个系统的时间分辨率达到毫秒(ms)级。在光源与样品之间，通常加有蓝色的长波截止滤光片和毫秒级电子快门。现在国外也有用亮度较大的发光二极管作为光源的，由于发光二极管光源的上升前沿较快，这样就可省去电子快门。光电转换接收器可用光电倍增管或光电三极管，它们的光谱响应要选择与植物荧光发射波长范围相吻合。在接收器之前通常加有红色的短波截止滤光片，以完全滤掉激发光。毫秒级记录设备可用瞬态记录器、记忆示波器或带有A/D转换的计算机等。在控制电子快门与记录荧光信号之间要有一个同步触发装置或同步程序，以保证取样和记录过程与电子快门动作相同步。为了减少样品对荧光的重复吸收，通常是把接受器与入射的激发光安排在样品的同一侧。叶绿素荧光动力学的测量方法调制式动力学荧光计至少应具有两束光：调制的弱测量光和连续的强化光。为了使测量光本身完全不被接收器直接检出，测量光中和接收器前使用的滤光片应完全无交叉重叠的光谱成分。光化光对接收器信号的干扰，可用折光转盘来解决。为了能够精确地测定Fo值，经验证明测量光到达样品表面时的强度要小于10ergs··cm-2·s-1。由于该强度在室温下不足以引起还原态QA的积累，因而荧光强度将始终保持在较低的、恒定的Fo水平上。此时若在照有测量光的样品上再叠加一束饱和光化光，植物荧光才迅速上升，并达到P峰，这就是Fv部分，此后荧光猝灭过程与前述非调制荧光猝灭过程相似。应该着重指出的是，由于调制式动力学荧光计采用了选频或锁相放大技术，使它只检出与测量光具有相同频率和固定相位差的植物荧光调制信号，而对其他背景光的干扰不放感。所谓调制技术，就是说用于激发荧光的测量光具有一定的调制（开/关）频率，检测器只记录与测量光同频的荧光，因此调制荧光仪允许测量所有生理状态下的荧光，包括背景光很强时。正是由于调制技术的出现，才使得叶绿素荧光由传统的“黑匣子”（避免环境光）测量走向了野外环境光下测量，由生理学走向了生态学。所谓饱和脉冲技术，就是打开一个持续时间很短（一般小于1s）的强光关闭所有的电子门（光合作用被暂时抑制），从而使叶绿素荧光达到最大。饱和脉冲（SaturationPulse,SP）可被看作是光化光的一个特例。光化光越强，PSII释放的电子越多，PQ处累积的电子越多，也就是说关闭态的电子门越多，F越高。当光化光达到使所有的电子门都关闭（不能进行光合作用）的强度时，就称之为饱和脉冲。打开饱和脉冲时，本来处于开放态的电子门将该用于光合作用的能量转化为了叶绿素荧光和热，F达到最大值。经过充分暗适应后，所有电子门均处于开放态，打开测量光得到Fo，此时给出一个饱和脉冲，所有的电子门就都将该用于光合作用的能量转化为了荧光和热，此时得到的叶绿素荧光为Fm。根据Fm和Fo可以计算出PSII的最大量子产量Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm，它反映了植物的潜在最大光合能力。在光照下光合作用进行时，只有部分电子门处于开放态。如果给出一个饱和脉冲，本来处于开放态的电子门将该用于光合作用的能量转化为了叶绿素荧光和热，此时得到的叶绿素荧光为Fm’。根据Fm’和F可以求出在当前的光照状态下PSII的实际量子产量Yield=ΦPSII=ΔF/Fm’=(Fm’-F)/Fm’，它反映了植物目前的实际光合效率。在光照下光合作用进行时，只有部分电子门处于关闭态，实时荧光F比Fm要低，也就是说发生了荧光淬灭（quenching）。植物吸收的光能只有3条去路：光合作用、叶绿素荧光和热。根据能量守恒：1＝光合作用＋叶绿素荧光＋热。可以得出：叶绿素荧光＝1－光合作用－热。也就是说，叶绿素荧光产量的下降（淬灭）有可能是由光合作用的增加或热耗散的增加引起的。由光合作用的引起的荧光淬灭称之为光化学淬灭（photochemicalquenching,qP）；由热耗散引起的荧光淬灭称之为非光化学淬灭（non-photochemicalquenching,qN或NPQ）。光化学淬灭反映了植物光合活性的高低；非光化学淬灭反映了植物耗散过剩光能为热的能力，也就是光保护能力。体内叶绿素荧光动力学有两个显著的特点：一是它可将植物发出的荧光区分为性质上完全不同的两个部分——固定荧光(Fo)部分和可变荧光(Fv)部分。固定荧光(Fo)代表不参与PSII光化学反应的光能辐射部分；可变荧光(Fv)代表可参与PSII光化学反应的光能辐射部分。因而根据可变荧光(Fv)在总的最大荧光(Fm=Fv十F。)中所占的比例（Fv／Fm)，即可简便地得出植物PSII原初光能转换效率，另一个特点是，荧光动力学是测定植物从暗中转到光下，其光合作用功能从休止钝化状态转为局部活化状态，直到全部正常运转状态过程中的荧光动态变化，因而它包含着十分丰富的光合信息，这远不是一般静态焚光测量所能比拟的。在体内叶绿素荧光动力学测定中，当样品的叶绿素浓度和荧光计的激发光强恒定时，PSII原初电子受体QA的氧还状态是决定体内叶绿素荧光强弱的主要因素。当植物经一段时间暗适应，或用优先为光系统I(PSl)所利用的长波光照射后，其体内PSII的QA和随后的电子受体QB和PQ库等均完全失去电子而被氧化，这时PSII反应中心可接受光电子，即处于“开放”状态，这时荧光强度最弱，即为Fo，或处于“O”初始相；当植物被饱和光激发，使PSII电子受体QA、QB和PQ库等完全被还原时，PSII反应中心不再接受光电子，即处于“关闭”状态，这时荧光强度最强，即为Fm，或处于“P”峰相。植物经短暂照光达到“P”峰后，由于一些光合酶系逐渐被活化，使PSI开始运转，而将PSII还原侧的还原态电子受体QA-、QB-和PQH2等再氧化，从而引起荧光强度的猝灭，这称为qQ猝灭；植物在光的持续照射下，紧接着qQ猝灭的增加，在光合膜的两侧逐渐建立起质子梯度和形成膜高能态。试验证明，它们也可造成荧光猝灭，这种猝灭称为能量猝灭，或qE淬灭。qQ和qE灭是植物在正常生理条件下的两个最主要的猝灭成分。qQ猝灭因为是由QA-等再氧化所造成，因而它与光合电子传递、光合放氧等过程直接相关；而qE猝灭因为是由质子梯度和膜高能态所引起，因而它只与ATP的形成、积累以及与光合膜的状态有关，而与光合电子传递和光合气体交换无直接的联系。以上对荧光动力学中两种猝灭成分的分析称为Q分析，它对于正确理解和分析叶绿素荧光动力学猝灭过程的光合生理意义及其与其他光合参数，特别是与气体交换的关系，是十分重要的，它消除了过去看起来似乎是相互矛盾的一些试验结果，从而为叶绿素荧光动力学在理论上的进一步深入研究和在实际中的广泛应用扫清了障碍，这是近年来荧光动力学在理论研究方面的重要新进展。根据上述Q分析理论，西德Schreiber博土设计了一种新型的脉冲调制荧光计，该仪器在过去一般调制荧