IC50

IC50是指“反应”被抑制一半时抑制剂的浓度，这里的反应可以是酶催化反应、抗原抗体反应等。在凋亡方面，可以理解为一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50%，该浓度称为50%抑制浓度，即凋亡细胞与全部细胞数之比等于50%时所对应的浓度，IC50值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱导能力越强，该数值越低,当然也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。半抑制浓度（或称半抑制率），即IC50。在间接竞争ELISA标准曲线中是一个非常重要的数据，标准曲线是一个S型曲线。ICELISA中，不添加抑制物质的对照孔的OD值为B0，添加了抑制物质的孔的OD值为BB/B0%就叫做结合率，在结合率为50%时所对应的抑制物质的浓度就叫做IC50。一般IC50的数值越小，说明你的抗体的特异性能越强！最小检测限为试剂盒标准曲线的最小的浓度，小于最小浓度或大于最大浓度，即不在曲线范围内的都不准确，大于最大浓度可以稀释后测。IC50为50%抑制浓度即B/B0=50%时所对应的浓度，半数抑制是用来衡量抗体灵敏度的半数抑制越低，说明抗体的灵敏度越高。通常来说，试剂盒最大和最小量程应该是该抗体用来检测标准品的检测限，检测限分最大和最小检测限。检测下限一般为理论值，是根据标准曲线算出来的理论上可以检测到的最小的值；定量限为实际检测时可以定量的最低的值；而最大检测限就是实际操作中抑制率达到100%时的药物浓度。检测下限（LOD）对应的OD值：OD(LOD)=B0－3SD定量限（LOQ）对应的OD值：OD（LOQ）=B0－10SD酶活力单位（U，activeunit）酶活力的度量单位。1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。酶活力单位：用来表示酶活力大小的单位，通常用酶量来表示。其中一个称酶活力国际单位，规定为：在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物，或者底物中1微摩尔有关基团所需的酶量，称为一个国际单位（IU，又称U）。另外一个国际酶学会议规定的酶活力单位是Kat，规定为：在最适条件下，1秒钟能使1摩尔底物转化的酶量。Kat和U的换算关系：1Kat=6×107U，1U=16.67nKat酶的比活力（specificactivity）：是指每毫克质量的蛋白质中所含的某种酶的催化活力。是用来度量酶纯度的指标。是生产和酶学研究中经常使用的基本数据。酶的转化数(Kcat)：在单位时间内每一活性中心或每分子酶所能转换的底物分子数。生产中并不常用抑制剂和酶的结合速度要看情况而定，主要和你的抑制剂有关，许多情况下结合得很快，但是也有slowbindinginhibitor(我最近做的一个就是，抑制剂和酶的平衡时间很长，中途加根本看不出变化，必须吧抑制剂和酶一起incubate15分钟，然后用底物引发).如果只是IC50，一个底物浓度就够了。但是IC50会随底物浓度的变化而变化，所以你要指定一个底物的浓度，发表IC50的时候要注明你底物的浓度。这个浓度如果没有任何依据的随意指定一个，感觉上就会不专业。如果你已经有其它人关于这个酶和其它抑制剂的资料(并且上面详细注明了所用的酶和底物的浓度，还有对底物的Km)，你当然可以省事的在其它人的底物浓度下测你的IC50。不过如果你没有详细的相关资料或者不很肯定查到的相关数据，最好是先自己做一下这个酶的动力学曲线。具体怎么做动力学找本书上就有了。简单的就是根据相关资料(新的酶就要看自己的感觉了)设计几个底物浓度，然后调整加的酶的浓度使得所有速度曲线在引发后的几分钟都是线性的，而且前几分钟消耗的底物量一定不要超过底物总浓度的10％。底物的浓度你要高高低低地试几次，然后估算出Km的大致值(加许多底物让酶饱和，这个时候测出的速度应该是Vmax,Km就是使得速度为Vmax一半的时候的底物浓度)。然后你设计10～15个底物浓度点上及5倍Km，下及1/5Km，注意Km附近点要密集些因为正是曲线的拐弯处。情况好的话你就会拿到那个酶的Michaelis-Menten曲线(X轴底物浓度Y轴速度)，处理后得到Km和Kcat。我觉得最后指定的测IC50的底物浓度要么是Km，要么是3xKm或5xKm(饱和)。当然如果你有决心的话，最好是做个关于抑制剂的全动力学以得出Ki。具体的方法就是选5～8个底物浓度点，然后在每个底物浓度下测4~6个抑制剂浓度的反应速度，我一般是为保准确每个数据点重复2～3次，工作量不小，但是Ki不受其它因素影响，直接表征抑制剂对酶的结合能力，是适合发表的正式数据一、原理噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。二、试剂材料准备与实验仪器1）对数生长期细胞2）受试因素（药物）3）MTT：以PBS配制成5mg./ml，抽虑除菌，保存在4˚C4）DMSO（二甲基亚砜）5）96孔板6）酶联免疫检测仪7）细胞培养箱三、实验步骤（实用于贴壁细胞）1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，1×104/孔，细胞浓度可以调整。2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁。3）加入不同浓度的药物，如1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml的药物，时间依据实验需要，一般3天。4）小心吸去上清，PBS轻轻洗涤，再次离心，弃上清。5）每孔加入180ul新鲜RPMI1640培养液，再加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。6）终止培养（可离心，1000rpm，10min），小心吸去孔内培养液。7）每孔加入150ul二甲基亚砜（也可以用酸化异丙醇，10%SDS代替），置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。8）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。三、结果统计学处理所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p0.05时为相差显著，p0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50。或计算抑制率。四、注意事项与常见问题1）实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。2）每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度调整，并进行预实验调整浓度，太多敏感性降低，太少观察不到差异。3）贴壁细胞加MTT前吸掉培养液，悬浮细胞可以不吸除培养液，再加入0.5%MTT，量为20ul/孔。4）如果不使用96孔板，培养基超过100ml，MTT按照10%的比例加入。5）MTT一般4度保存两周，注意避光保存，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，配制完后可过滤一下。6）对于DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值；而对于SDS和酸化异丙醇，则选用570nm，并且建议以655nm作为参考波长。7）96孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度，使得边缘的孔水分蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。对于这种现象，要保证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次数和时间。8）注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。9）没有去掉上清直接加DMSO，沉淀会很难溶解。加DMSO前要把液体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸去，也可在倒之前先用平板离心机离心96孔板，2000r，5分钟，然后吸掉上清。加入DMSO后可用排枪反复抽吸助溶，溶解后尽快检测。10）为了减少误差，培养板的四边孔只加培养基或只接种细胞，而不作为指标检测孔。11）除置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解外，可用枪头吹打，加快溶解，效果亦可；或放入37度放孵箱15分钟溶解结晶。12）关于如何计算IC50方法有多种(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)(2)Bliss法:自己查阅书籍(3)IC50计算软件，见下面附件（4）自己用EXCEL做趋势线来求IC50，关于LD50的方法与此相似！（5）在线求IC50或EC50：）计算抑制率，公式[（对照-本底）-（给药-本底）]/（对照-本底）*100%.MTT试验的一些细节问题(一)细胞1.选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。2.药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。3.时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。4.培养时间。200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。6.理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。8.避免血清干扰。用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。(二)实验步骤贴壁细胞：1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。2.5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况3.5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。5.终止培养，小心吸去孔内培养液。6.每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）悬浮细胞：1.收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul；②加ActinomycinD（有毒性）10u