2×CTAB法植物总DNA提取

2×CTAB法植物总DNA提取1.液氮研磨1g左右的植物组织，转移到离心管中。改用研磨枪在冰上研磨，不加β-巯基乙醇研磨时可加入适量的PVP、β-巯基乙醇。若CTAB准备2-3天内用完，则可将PVP、β-巯基乙醇直接加入其中。2.加入500µl的2*CTAB(60℃或65℃预热),颠倒混合均匀后在60℃或65℃水浴30m-1h小时,其间要上下颠倒混匀数次。3.取出离心管，加入等体积的24：1（三氯甲烷：异戊醇），上下颠倒充分混合。若量多，则可以直接侧立于摇床上晃动10分钟。4.12000转速离心5-10min。将离心管动作轻缓的取出转子，放置于离心管架上。a.离心后溶液分三层：上层为水相；中层为碎片和蛋白相；底层为氯仿b.迅速进入下一步，以免各相混合5.用移液枪吸取管中上层水相，动作一定要轻缓，不可搅动其它两层。a.此步骤要宁舍不贪多，尽量避免吸取到下层液体。b.若上步骤中中间层较厚，则继续加入等体积24：1，再次抽提一次，直至中间层较薄。6.在抽提出的水相中加入1/3体积的5M的KAc及等体积的异丙醇（4℃预冷），轻轻晃动混合均匀后在-20℃沉淀。沉淀至少15分钟至过夜。6-1在抽提出的水相中加入1/10体积醋酸钠（pH5.2,3M），混匀后，加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃沉淀15min至过夜。6-3.在抽提出的水相中加入加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃沉淀15分钟至过夜。a.时间越长，DNA的产量越多，污染也越多7.12000转速离心5-10min，去上清，倒置于吸水纸上数分钟，加入700µl70%的酒精，上下颠倒数次，洗涤沉淀。12000转离心5-10m，去上清，倒置于吸水纸上数分钟。重复一遍。8.12000转速离心5-10min，去上清，倒置于吸水纸上数分钟，最后置于超净工作台中吹干。9.在离心管中加入30-50µl的灭菌去离子水或者TE溶液，4℃放置数小时，使其充分溶解。10.用琼脂糖凝胶检测结果。11.-20℃——-70℃低温保存。去除总DNA中的RNA污染先做预扩增实验，若RNE污染无严重影响则舍去该步骤A1.在总DNA溶液中加入灭菌去离子水或者TE溶液调整总体积至200µl,加入10µRNase-A（10mg/ml）4℃过夜，或者37℃1h.2.用等体积的24：1抽提。3.沉淀DNA——洗涤DNA——干燥DNA——溶解DNA——-20℃——-70℃低温保存。B直接加入10µRNase-A（10mg/ml）后冷冻保存。试剂配方1MTris-HCl(pH7.4,7.6,8.0)pH浓HClTris去离子水7.4约70ml121.1g定容至1升7.6约60ml121.1g定容至1升8.0约42ml121.1g定容至1升高温高压灭菌后，室温保存注意：应该在溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH大约降低0.03个单位5×TBE缓冲液Tris硼酸0.5MEDTA（pH8.0）去离子水54g27.5g20ml定容至1L室温保存50×TAE缓冲液Tris冰乙酸0.5MEDTA（pH8.0）去离子水242g57.1ml100ml定容至1L室温保存2×CTAB成分终浓度已有溶液浓度配100ml所加量CTAB2%2gTris-HCl（pH8.0）100mM1M10mlEDTA20mM0.5M4mlNaCl1.4M5M28ml0.5MEDTA（pH8.0）二水乙二胺四乙酸二钠Na2EDTA·2H2ONaOH去离子水186.1g约20克定容至1L高温高压灭菌，室温保存。注：只有pH值接近8.0时，EDTA才能完全溶解。溶解过程可在磁力搅拌器上剧烈搅拌。耗材准备：需要灭菌者：1.5ml离心管、研磨枪头、蓝色枪头、黄色枪头、其他：卫生纸（吸水用）、镊子、封口膜、挑菌针、酒精灯、70%酒精、离心管架子、离心管盒子、移液枪。CTAB法提取植物基因组药品：2*CTAB终浓度组分药品用量0.1M/L1MTris-HCl(pH8.0)100ml20nM/L0.5MEDTA(pH8.0)40mlNaCl82gCTAB20gPVP4020g加去离子水800ml充分溶解定容到1L。120℃1.5个大气压，灭菌20分钟用之前加0.2-1%的0.5MEDTA(pH8.0)配制量：1L配制方法：1.称取186.1gNa2EDTA•2H2O，置于1L烧杯中。2.加入约800mL的去离子水，充分搅拌。3.用NaOH调节pH值值8.0（约20gNaOH）。注意：pH值至8.0时，EDTA才能完全溶解。4.加去离子水将溶液定容至1L。5.适量分成小份后，高温高压灭菌。6.室温保存1MTris-HCl(pH8.0)氯仿：异戊醇24:1异丙醇流程1、研钵预冷，叶片放入研钵，加液氮，研磨成粉末，用小勺放入2.0mlEP管。2、加入65℃预热的2*CTAB600ul,摇匀;3、65℃水浴1小时，10min摇动一次4、12000rpm离心10min,取上清到一新的EP管中。（次步骤视情况可省略）5、加入200ul氯仿：异戊醇(24:1)。6、12000rpm离心10min,取上层水相到一新的EP管中。7、加入等体积的异丙醇，轻轻上下摇动10次，静置10min。8、12000rpm离心10min，弃上清9、加入75%乙醇1.0ml,摇动10、12000rpm离心2min，弃上清11、吸取多余乙醇，室温吹干12、加入50ul的ddH2O,或TE溶解。-20℃保存CTAB法提取植物基因组DNACTAB法原理CTAB（Cetyltrimethylammoniumbromide），十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸的特性。当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3mol/LNaCl）时，CTAB-核酸的复合物从溶液中沉淀，通过离心就可将其与蛋白，多糖类物质分开，在经过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去在高离子强度的溶液中(0.7mol/LNaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，不能沉淀核酸。CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。另外，它还能保护DNA不受内源核酸酶的降解。主要试剂与溶液的配制：PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30）巯基乙醇氯仿︰异戊醇（24︰1）异丙醇70%乙醇Tris-苯酚RNaseA无水乙醇CTAB溶液：CTAB——20g/LNaCl（58.44）——1.4mol/L（81.816g）EDTA（292.25）——10mmol/L（2.9225g）Tris（121.14）——100mmol/L（12.114g）pH8.01×TE缓冲液：EDTA（292.25）——1mmol/L（0.29225g）Tris（121.14）——10mmol/L（1.2114g）pH8.0NaAC溶液：NaAC（82.03）——3mol/L（246.09g）pH4.0植物总DNA的提取1、取适量甘薯新鲜叶片，用液氮迅速研磨，中间加PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30）少许，成粉末后转入10mL的离心管中，放入液氮或-80℃冰箱储存（在研磨样品时，研的细和研的粗，提出的DNA量可以相差几倍，所以，在液氮保护的很好的情况下尽量多研磨几次）。2、将（200ml）CTAB溶液放于65℃水浴锅中预热。3、加4ml巯基乙醇到预热的200mlCTAB中。4、速加3ml预热的CTAB到装有粉末的10mL离心管中，之后放入65℃水浴锅中，保温30~60min，期间轻摇数次（一般20min左右一次，刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要轻柔）。5、加入3~4ml氯仿︰异戊醇（24︰1）（在通风橱中操作），轻摇混匀至乳白色（100~200次，剧烈晃动会使DNA机械切割）。6、15~20℃，11000rpm离心15min（CTAB配平，相对应的离心管，质量相差0.03g）。7、取上清（用剪过的枪头进行操作，过尖的枪头会把DNA链弄断。），加0.6倍体积的异丙醇，摇均（有絮状物析出，可放入4℃冰箱过夜）。8、用毛细玻璃管将DNA絮状物挑出（DNA絮状物尽量要挑出，不要离心，因为离心后虽然产量会增大，但是不完整的DNA也增多）（或4℃，10000rpm离心5min，弃上清），放入新的离心管中，用70%乙醇漂洗2次，放置超净台中吹干。9、加入2ml1×TE缓冲液溶解，可放入4℃冰箱保存（酶活性在4℃或65℃水浴中最低，防止酶降解DNA）。10、未溶解的，可放入65℃水浴中促其溶解，10min后拿出冷却至室温，可重复，直至溶解。11、加入2.5ulRNaseA（RNaseA提前拿出融化），10℃离心，升至4000rpm即停，使RNaseA和溶液充分混合。12、37℃水浴，保温1h。13、加入1mlTris-苯酚、1ml氯仿︰异戊醇（24︰1），摇均配平，4℃，11000rpm离心10min。14、取上清，加1×TE补至2ml，加2ml氯仿︰异戊醇（24︰1）摇均配平，4℃，11000rpm离心10min。15、如仍有白色蛋白质沉淀，则重复步骤14。16、取上清，加0.1倍上清液体积的NaAC，2.5倍上清液体积的无水乙醇（提前放入-20℃冰箱），摇均，放入-20℃冰箱沉淀30min。17、用毛细玻璃管将DNA挑出（或用无水乙醇配平，4℃，10000rpm离心4min，弃上清），放入新的离心管中，用70%乙醇漂洗2次，转入1.5ml离心管，放置超净台中吹干。18、将DNA溶于适量的1×TE缓冲液中，短期4℃保存，长期-80℃冰箱中储存。19、取少量DNA溶液进行琼脂糖电泳，胶浓度为0.8%，检测其完整性。并用紫外分光光度计测其浓度。注解：1、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)：是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。2、CTAB：溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；3、NaCl：提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，在于液相中；4、EDTA：螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；5、Tris(pH8.0)：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；6、β-巯基乙醇：是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。7、苯酚：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶，蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：（1）有效变性蛋白质；（2）抑制了DNase的降解作用。缺点：（1）能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。（2）不能完全抑制RNase的活性。8、氯仿：克服酚的缺点，加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚（酚易溶于氯仿中）。9、异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。基因组DNA提取常见问题：1、DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质：重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质，重新沉淀DNA。2、DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应：让酒精充分挥发，增加70%乙醇洗涤的次数(2-3次)3、DNA中有RNA的存留：加入RNase降解RNA。4、材料不新鲜或反复冻融：尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融，液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液。5、未很好抑制内源核酸酶的活性：在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量。6、提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断：细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。7、外源核酸酶污染：所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。8、反复冻融。将DNA分装保存于缓冲液中，避免