总大肠菌群数量测定

总大肠菌群在饮用水的微生物安全监测中，普遍采用正常的肠道细菌作为粪便污染指标，而不是直接测定肠道致病菌。总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革氏阴性无芽胞杆菌。总大肠菌群系指每升水样中所含有的总大肠菌群的数目。总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。一多管发酵法1应用范围1.1本法适用于饮用水、水源水，特别是浑浊度含量高的水质中总大肠菌群的测定。1.2水样中总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在。2原理根据总大肠菌群应具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽胞杆菌，在37℃24h内能发酵乳糖并产酸产气，能在选择性培养基上产生典型菌落。3仪器3.1显微镜3.2革兰氏染色用有关器材。3.3高压蒸汽灭菌器。3.4干热灭菌箱。3.5恒温箱。3.6冰箱。3.7放大镜。3.8试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等，置于干热灭菌箱中160℃灭菌2h4培养基4.1乳糖蛋白胨培养液4.1.1成分蛋白胨10g牛肉膏3g乳糖5g氯化钠5g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml蒸馏水1000ml4.1.2制法将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于1000ml蒸馏水中加热溶解，调整pH为7.2~7.4，再加入1ml1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，置高压蒸汽灭菌器中，以115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。4.2三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制。4.3品红亚硫酸钠培养基（供多管发酵法用）4.3.1成分蛋白胨10g乳糖10g磷酸氢二钾3.5g琼脂15~30g蒸馏水1000ml无水亚硫酸钠5g左右5%碱性品红乙醇溶液20ml4.3.2储备培养基的制备先将琼脂加至900蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调整PH值为7.2~7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌中以115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。4.3.3平皿培养基的配制将上法制备的储备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌空试管中。再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解后，置于沸水浴中煮沸10min以灭菌。用灭菌吸管吸取已灭菌的严硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色褪成淡粉红色为止。将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加入已融化的储备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此种培养基适量倾入于已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后置冰箱内备用。此种已制成的培养基于冰箱内保存不宜超过二周，如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。4.4伊红美蓝培养基4.4.1成分蛋白胨10g乳糖10g磷酸氢二钾2g琼脂20~30g蒸馏水1000ml2%伊红水溶液20ml0.5%美蓝水溶液13ml4.4.2储备培养基的制备先将琼脂加至900ml蒸馏水，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调整PH为7.2~7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌器内以115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。4.4.3平皿培养基的制备将上法制备的储备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量已灭菌的2%伊红水溶液及一定量已灭菌的0.5%美蓝水溶液，加入已融化的储备琼脂内，并充分混匀（防止产生气泡）立即将此种培养基适量倾入于已灭菌和空平皿内，待其冷却凝固后置冰箱内备用。5步骤5.1生活饮用水5.1.1初发酵试验：在2个各装有已灭菌50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（4.2）的大试管或烧瓶中（内有倒管）内，以无菌操作各加入水样100ml；在10支装有已灭菌5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作各加入水样10ml，混匀后置于37℃恒温箱内培养24h。5.1.2平板分离：经培养24h后，将产酸产气及只产酸的发酵管，分别接种于品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基上，再置于37℃恒温箱内培养18~24h，挑选符合下列特征的菌落，取菌落的一小部分进行涂片、革兰氏试验、镜检。品红亚硫酸钠培养基上的菌落：紫红色，具有金属光泽的菌落。深红色，不带或略带金属光泽的菌落。淡红色，中心色较深的菌落。伊红美蓝培养基上的菌落：深紫黑色，具有金属光泽的菌落。紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落。淡紫红色，中心色较深的菌落。5.1.3复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽胞杆菌，则挑取该菌落的另一部分再接种于普通浓度乳糖蛋白胨培养液中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管的最典型的菌落1~3个，然后置于37℃恒温箱中培养24h，有产酸产气者（不论倒管内气体多少皆作为产气论），即证实有总大肠菌群存在。5.1.4根据证实有总大肠菌群存在的阳性管（瓶）数查表1，报告每升水样中的总大肠菌群数。表1总大肠菌群数检数表（接种水样总量300ml—100ml2份，10ml10份）100ml水量的阳性管（瓶）数10ml水量的阳性管数012每升水样中总大肠菌群数每升水样中总大肠菌群数每升水样中总大肠菌群数012345678910＜33711141822273136404813182430364351606911182738527092120161230＞2305.2水源水5.2.1将水样作1：10稀释。5.2.2于各装有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（4.2）的5个试管中（内有倒管），各加入10ml水样；于各装有10ml乳糖蛋白胨培养液（4.1）的5个试管中（内有倒管），各加入1ml水样，于各装有10ml乳糖蛋白胨培养液（4.1）的5个试管中（内有倒管），各加入1ml1：10稀释水样。共计15管，三个稀释度。以后的检验步骤同上述生活饮用水的检验方法。5.2.3根据证实有总大肠菌群存在的阳性管数查表2报告每升水样中的总大肠菌群数。表2总大肠菌群检数表（接种水样总量55.5ml，其中5份10ml水样，5份1ml水样，5份0.1ml水样）