1株异养硝化好氧反硝化不动杆菌的分离及脱氮性能

第11卷　第7期环境工程学报Vol.11,No.72017年7月ChineseJournalofEnvironmentalEngineeringJuly2017基金项目:上海市农委项目资助(沪农科攻字(2015)第1-4号)收稿日期:2016-04-25;录用日期:2016-06-22第一作者:颜薇芝(1989—),女,硕士研究生,研究方向:环境微生物。E-mail:[e-mail]∗通信作者,E-mail:[e-mail]1株异养硝化好氧反硝化不动杆菌的分离及脱氮性能颜薇芝1,2,张汉强3,余从田3,雷艳芳3,郝健1,史吉平1,2,∗1.中国科学院上海高等研究院,上海2012102.中国科学院大学,北京1000493.光明食品(集团)有限公司,上海200040摘　要　通过异养硝化培养基富集,从活性污泥中筛选出一株高效的异养硝化菌,通过形态观察、生理生化特征及16SrD-NA序列分析鉴定为不动杆菌(Acinetobacter.sp),命名为YN3。通过单因子实验和正交实验对其异养硝化和好氧反硝化特性进行研究,得出菌株YN3硝化作用的最适条件为:碳源为柠檬酸钠、C/N为15,pH为7.0、温度为30℃、转速为200r·min-1,此时氨氮去除率为99.3%,其中37.8%的氮被转化成气体产物而去除,剩余部分氮转化为细胞生物量。菌株YN3能够利用亚硝酸盐和硝酸盐进行生长代谢,去除率分别为100%和80.61%。说明菌株YN3具有很强的异养硝化和好氧反硝化特性,能够独立快速高效地完成异养硝化和好氧反硝化脱氮过程,具有潜在的实际废水应用价值。关键词　异养硝化;好氧反硝化;生物脱氮;不动杆菌;正交实验中图分类号　X172　　文献标识码　A　　文章编号　1673-9108(2017)07-4419-10　　DOI:10.12030/j.cjee.201604200IsolationofAcinetobactersp.YN3anditsHeterotrophicnitrification-aerobicdenitrificationcharactersYANWeizhi1,2,ZHANGHanqiang3,YUCongtian3,LEIYanfang3,HAOJian1,SHIJiping1,2,∗1.ShanghaiAdvancedResearchInstitute,ChineseAcademyofSciences,Shanghai201210,China2.UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China3.BrightFood(Group)Co.Ltd.Shanghai201210,ChinaAbstract　Anefficientheterotrophicnitrificationbacteriaspecieswasisolatedfromactivatedsludgethroughen-richmentandculturedwithaheterotrophicnitrificationmedium.ThebacteriawasidentifiedasAcinetobactersp.bymorphological,physiological,andbiochemicalcharacteristics,aswellas16SrDNAsequenceanalysis.ThisstrainwasnamedAcinetobactersp.YN3.Single-factorandorthogonalexperimentsshowedthatefficienthetero-trophicnitrificationofstrainYN3occurredwithsodiumcitrateasthecarbonsource,aC/Nratioof15,pHof7.0,temperatureof30℃,andarotatingspeedof200r·min-1.Wheninitialammoniawas300mg·L-1,theammoniaremovalefficiencyreached99.3%,ofwhich37.8%wasconvertedtogasandescapedtoair,andtherestwasfixedtocellbiomass.Usingnitriteandnitrateasanitrogensource,thenitrogendegradationratioswere100%and80.6%,respectively.ItwasindicatedthatstrainYN3couldremovenitrogenthroughheterotrophicni-trification-aerobicdenitrificationquicklyandeffectively.Thisstrainthereforehasgoodpotentialforuseinwastewatertreatment.Keywords　heterotrophicnitrification;aerobicdenitrification;biologicalremovalofnitrogen;orthogonalexperi-ments;Acinetobactersp.　　随着经济社会的快速发展,工农业废水中的氮素含量日益增加,含氮物质的超标排放将引起严重的环境问题。因此,对高浓度含氮污水的处理显得尤为迫切[1]。污水中的氮素主要以氨氮和有机氮的形式存环境工程学报第11卷在,脱氮是污水处理的一个重要指标,传统的生物脱氮是基于好氧自养硝化作用和厌氧异养反硝化的过程[2]。然而,这种传统的工艺水力停留时间长、能耗大,且基建费用高,同时,自养菌在高浓度的氨氮和有机废水中难以存活,从而限制其在处理高浓度氨氮废水中的应用。近年来为了克服这些限制因素,人们开发了一些新型的生物脱氮工艺,包括部分亚硝化、好氧反硝化和厌氧性氨氧化等。早在1983年,ROBERTSON等[3]筛选得到一株具有异养硝化-好氧反硝化能力的菌株Thiosphaerapan-totropha。该菌在好氧生长结束后,就会立即迅速地进行反硝化作用。后来多个种属的具有异养硝化-好氧反硝化的细菌被报道,包括粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)[2,4]、施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)[5]、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[6]、土壤杆菌属(Agrobacteriumsp.)[7]、不动杆菌属(Acinetobactersp.)[8-9]、克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)[10]、芽孢杆菌属(Bacillussp.)[11-12]、泛养硫球菌(Thio-sphaerapantotropha)[3]等。异养硝化细菌与自养菌相比,具有更高的生长率,并能利用有机物质作为碳源和能源在有氧条件下将氨氮转变为N[4,13]2。此外,反硝化过程中产生的碱性可以部分中和由硝化过程产生的酸[12]。因此,同步硝化反硝化可以实现低运营成本和在一个反应器达到高速脱氮的效果。虽然大量的新型脱氮菌株已经被报道,但是人们对异养硝化-好氧反硝化菌的分子学研究、反应机理及在废水脱氮中的应用研究仍然不够充分。本研究从活性污泥中筛选出1株异养硝化-好氧反硝化菌,经鉴定为不动杆菌属,通过单因素实验和正交实验对该菌的脱氮性能进行了分析,旨在为脱氮功能菌强化处理高浓度氨氮废水提供理论支持。1　实验部分1.1　培养基硝化富集培养基:(NH4)2SO40.4g·L-1,柠檬酸钠3.5g·L-1,MgSO4·7H2O1g·L-1,NaCl0.12g·L-1,MnSO4·H2O0.01g·L-1,FeSO4·7H2O0.02g·L-1,KH2PO40.25g·L-1,Na2HPO40.3g·L-1,pH7.0~7.5。固体培养基添加20g·L-1琼脂。异养硝化培养基:(NH4)2SO40.35g·L-1,柠檬酸钠3.03g·L-1,MgSO4·7H2O1g·L-1,KH2PO40.25g·L-1,Na2HPO40.3g·L-1,pH7.0~7.5。反硝化培养基:KNO30.53g·L-1(NaNO20.5),柠檬酸钠3.0g·L-1,KH2PO40.25g·L-1,Na2HPO40.3g·L-1,MgSO4·7H2O1g·L-1,pH7.0。溴百里酚蓝(BTB)培养基:KNO31g·L-1,琥珀酸钠8.5g·L-1,MgSO4·7H2O1g·L-1,CaCl20.15g·L-1,FeSO4·7H2O0.05g·L-1,KH2PO40.25g·L-1,Na2HPO40.3g·L-1,1%溴百里酚蓝乙醇溶液1mL,琼脂20g·L-1。培养基[14-16]使用前均需置于灭菌锅中,121℃灭菌20min。1.2　富集培养及菌株分离活性污泥取自江苏省常州市某吕业公司污水处理池,取5mL污泥悬浮于45mL硝化富集培养基,30℃,200r·min-1摇床富集培养12h,将富集液进行梯度稀释涂布于硝化富集固体培养基,培养1d后,挑取形态大小不一的单菌落,多次划线分离纯化得到10余株初筛菌株。挑取初筛菌株接种于溴百里酚蓝固体平板,挑取培养基出现蓝色晕圈的菌株,进行异养硝化性能和好氧反硝化性能测定,定量筛选出具有较高异养硝化能力和好氧反硝化能力的菌株。1.3　菌株的鉴定菌株鉴定采用16SrDNA序列比对法。提取菌株总DNA,利用一对通用引物扩增菌株16SrDNA。上游引物为8f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′),下游引物为1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。基因测序后通过GenBank进行同源性序列分析,应用MEGA5.0软件构建该菌株系统发育树。1.4　菌株YN3的脱氮性能研究1.4.1　单因素实验研究不同培养条件对菌株YN3异养硝化的影响利用单因素实验研究碳源、温度、转速、pH、C/N和氨氮浓度对氨氮去除效果的影响。培养条件为C/0244第7期颜薇芝等:1株异养硝化好氧反硝化不动杆菌的分离及脱氮性能N为10,氨氮浓度为70mg·L-1,转速为200r·min-1,pH为7,碳源选择柠檬酸钠、琥珀酸钠、葡萄糖、乙酸钠和蔗糖,以下实验均按上述要求固定其他因素,只改变研究的单因素条件;温度分别为20、30和37℃;摇床转速分别为100、150、200和250r·min-1;pH分别为5、6、7、8和9;C/N分别为5、10、15和20;初始氨氮浓度分别为50、100、150、200和250mg·L-1。所有实验一式3份。将处于对数期的菌液以5%(OD600=1)的接种量接种于装有100mL异养硝化培养基的500mL三角瓶中,恒温培养,测定水样中OD600、氨氮(NH+4-N)、硝氮(NO-3-N)、亚硝氮(NO-2-N)、羟氨(NH2OH-N)和总氮(TN)的质量浓度变化。1.4.2　正交实验优化培养条件为优化菌株YN3的脱氮条件,以氨氮为唯一氮源,设计L18(35)正交实验,因素水平表见表1。将菌液以相同接种量接种于装有100mL异养硝化培养基的500mL三角瓶中,以氨氮降解效率为反应值分析得到最优培养条件。初始氨氮的质量浓度为70mg·L-1,依照不同的碳氮比计算碳源质量。表1　正交实验因素水平表Table1　Orthogonalexperimentfactorleveltable因素A(碳源)B(温度/℃)C(转速/(r·min-1))D(pH)E(C/N)水平1葡萄糖2010055水平2琥珀酸钠30150715水平3柠檬酸钠372009201.4.3　菌株YN3的适应性进化实验设计1)菌株YN3的适应性进化。配置不同氨氮浓度(70、150、200、250和300mg·L-1)的硝化培养基,以菌株YN3作初始育种菌株。以氨氮浓