BAF反应器中好氧反硝化菌的分子鉴定及分析

第３４卷第１期土木建筑与环境工程Ｖｏｌ．３４Ｎｏ．１２０１２年２月ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｉｖｉｌ，Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒａｌ＆ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＦｅｂ．２０１２犅犃犉反应器中好氧反硝化菌的分子鉴定及分析张文艺，陈雪珍，陆丽巧，闫　刚，赵婷婷，姚立荣（常州大学环境与安全工程学院，江苏常州２１３１６４）收稿日期：２０１１０４３０基金项目：“十一五”国家科技重大专项（２００８ＺＸ０７１０１００７０１）；江苏省自然科学基金项目（ＢＫ２００９３０４０５）作者简介：张文艺（１９６８），男，博士，教授，主要从事水污染控制与生态修复研究，（Ｅｍａｉｌ）[e-mail]。摘　要：从处理高浓度蛋白质废水的ＢＡＦ反应器中经富集分离出一株能以ＫＮＯ３为唯一氮源生长的好氧反硝化菌Ｎ１。为进一步研究其分子生物学特性，采用传统的生理生化特征鉴定法及１６ＳｒＤＮＡ序列分析法对该菌株进行研究，并与已知种和相关种的菌株进行比较，得到系统发育树状图。结果表明，菌株Ｎ１的１６ＳｒＤＮＡ的核苷酸序列与蒙氏假单胞菌（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍｏｎｔｅｉｌｉｉｓｔｒａｉｎＣＩＰ１０４８８３）的同源性为９９．２％，在细菌系统发育分类学上属于假单胞菌属，蒙氏假单胞菌。好氧反硝化菌株Ｎ１的序列已向ＧｅｎＢａｎｋ提交并得到登录号为ＨＱ８４０７７１。关于蒙氏假单胞菌的反硝化研究在国内尚未见报道，此研究对于利用微生物技术治理环境中的氮污染具有较高的研究和应用价值。关键词：好氧反硝化菌；分子鉴定；１６ＳｒＤＮＡ；系统发育树中图分类号：Ｘ７０３．１　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１６７４４７６４（２０１２）０１０１１８０６犕狅犾犲犮狌犾犪狉犆犾犪狊狊犻犳犻犮犪狋犻狅狀，犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀犪狀犱犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮犃狀犪犾狔狊犻狊狅犳犃犲狉狅犫犻犮犇犲狀犻狋狉犻犳犻犲狉犖１犻狀狋犺犲犅犃犉犚犲犪狋狅狉犣犎犃犖犌犠犲狀狔犻，犆犎犈犖犡狌犲狕犺犲狀，犔犝犔犻狇犻犪狅，犢犃犖犌犪狀犵，犣犎犃犗犜犻狀犵狋犻狀犵，犢犃犗犔犻狉狅狀犵（ＳｃｈｏｏｌｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌａｎｄＳａｆｅｔｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＣｈａｎｇＺｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ２１３１６４，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）犃犫狊狋狉犪犮狋：ＡｓｔｒａｉｎｏｆａｅｒｏｂｉｃｄｅｎｉｔｒｉｆｉｅｒＮ１ｓｃｒｅｅｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅｂｉｏｆｉｌｍｏｆＢＡＦｃｏｍｂｉｎｅｄｒｅａｃｔｏｒｆｏｒｔｒｅａｔｉｎｇｈｉｇｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｒｇａｎｉｃｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｗａｓｔｅｗａｔｅｒｗａｓｆｏｕｎｄｃａｐａｂｌｅｏｆａｅｒｏｂｉｃｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｃａｎｂｅｕｓｅｄｎｉｔｒａｔｅｏｆｐｏｔａｓｈｂｙａｓｓｏｌｅｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｔｒａｉｎＮ１ｗａｓｍｏｓｔｓｉｍｉｌａｒｔｏＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍｏｎｔｅｉｌｉｉｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆ１６ＳｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅ，ａｎｄｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｈａｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｏｆ９９．２％ｗｉｔｈ１６ＳｒＤＡＮｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｓｔｒａｉｎＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍｏｎｔｅｉｌｉｉｓｔｒａｉｎＣＩＰ１０４８８３ｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍＧｅｎＢａｎｋｕｓｉｎｇＢＬＡＳＴ．Ａｔｐｒｅｓｅｎｔ，ｔｈｅｒｅａｒｅｆｅｗｒｅｐｏｒｔｓｏｎｔｈｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｎｉｔｒａｔｅｎｉｔｒｏｇｅｎｗｉｔｈＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍｏｎｔｅｉｌｉｉ．ＴｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｓｔｒａｉｎＮ１ｈａｖｅｂｅｅｎｓｕｂｍｉｔｔｅｄｔｏｔｈｅＧｅｎＢａｎｋｄａｔａｂａｓｅｓｕｎｄｅｒａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒｓＨＱ８４０７７１．ＳｏｆａｒｔｈｅｒｅａｒｅｆｅｗｓｔｕｄｉｅｓｒｅｌａｔｅｄｔｏａｅｒｏｂｉｃｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｏｎｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍｏｎｔｅｉｌｉｉ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅｓｔｕｄｙｉｓｈｉｇｈｖａｌｕａｂｌｅｆｏｒｔｒｅａｔｉｎｇｎｉｔｒｏｇｅｎｏｕｓｗａｓｔｅｗａｔｅｒｕｓｉｎｇｍｉｃｒｏｂｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．犓犲狔狑狅狉犱狊：ａｅｒｏｂｉｃｄｅｎｉｔｒｉｆｉｅｒ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；１６ＳｒＤＮＡ；ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅ　　２０世纪８０年代中期以来，人们在各种不同的环境诸如土壤、沟渠、池塘、活性污泥、沉积物等陆续分离出了一些好氧反硝化菌［１４］。Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ［５］在反硝化和脱硫系统中首次分离出好氧反硝化菌ＴｈｉｏｓｐｈａｅｒａＰａｎｔｏｔｒｏｐｈａ，在国内，杨希［６］等从活性污泥和土壤中分离得到３株反硝化能力较强的菌株，经形态观察、生理生化及１６ＳｒＤＮＡ分子鉴定，均为蜡状芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）；罗固源［７］等从ＯＧＯ反应器中分离出３株好氧反硝化菌Ｔ３、Ｔ６、Ｔ７，经１６ＳｒＤＮＡ同源性比较，确定Ｔ３、Ｔ７为赤红红球菌属，Ｔ６为戈登氏菌属；范利荣［８］等从实验室生物滤塔填料的生物膜中分离出一株无亚硝酸盐积累的好氧反硝化菌Ａ１，初步判定其为假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）；廖绍安［９］等从养虾池中分离出一株好氧反硝化菌，经形态学特征、生理生化反应及１６ＳｒＤＮＡ序列分析初步判定其为嗜麦芽寡养单胞菌（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）。本研究从处理高浓度蛋白质废水的ＢＡＦ反应器中分离出１株好氧反硝化菌Ｎ１，对其进行形态观察及生理生化分析，初步鉴定其为假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）［１０］。在此基础上，采用细菌的１６ＳｒＤＮＡ序列分析对好氧反硝化菌株Ｎ１进行细菌分类学的鉴定和系统发育树的构建，试图了解该好氧反硝化菌株Ｎ１的细菌分类学地位及部分生物学性质，并对该菌株的好氧反硝化特性进行研究，以期为好氧反硝化菌的分子生物学鉴定分析及资源利用提供技术基础。１　材料与方法１１　培养基组成好氧反硝化菌（暂命名为Ｎ１）分离自本实验室处理高浓度制药废水的ＢＡＦ反应器的生物膜中，培养基采用好氧反硝化培养基［１０］。１）灭菌条件：１．０３×１０５Ｐａ，１２１℃，２０ｍｉｎ。２）ＢＴＢ初筛培养基（／Ｌ）［１１］：琼脂２０ｇ；ＫＮＯ３１ｇ；ＫＨ２ＰＯ４１ｇ；ＦｅＣｌ２·４Ｈ２Ｏ０．５ｇ；ＣａＣｌ２０．２ｇ；ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ１ｇ；琥珀酸钠８．５ｇ；溴百里酚蓝（ＢＴＢ）（取０．１ｇＢＴＢ溶于１０ｍＬ酒精）１ｍＬ，ｐＨ至７．０～７．３。３）富集培养基（／Ｌ）：ＫＮＯ３４．０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４４．０ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．２ｇ，琥珀酸钠１９．４ｇ，ｐＨ７．２～７．５。４）固体培养基（／Ｌ）：ＫＮＯ３１ｇ；ＫＨ２ＰＯ４１ｇ；ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ１ｇ；ＫＣｌ０．５ｇ；琥珀酸钠２．８ｇ，琼脂２％，ｐＨ７．０～７．３。１２　主要试剂和仪器１）试剂：引物合成（Ｆ８、Ｒ１４９２）（上海捷瑞生物工程有限公司）；ｄＮＴＰＳ；１０×ｂｕｆｆｅｒ；ｒＴａｑ酶（ＴａＫａＲａ）；其余试剂均为中国产分析纯试剂。２）仪器：细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒（离心柱型）（上海捷瑞生物工程有限公司）；ＤＮＡ快速回收试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；倒置显微镜（ＸＤＳ／ＸＤＳＰＨＤ）（江西凤凰光学仪器有限公司）；高速离心机（ＴＧＬ１６Ｃ）（上海安亭科学仪器厂制造）；ＤＹＹ６０４电泳仪（南京新校园生物技术研究所）；２７２０ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＰＣＲ仪（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ（ＡＢ））；ＸＷ８０Ａ涡旋混合器（上海琪特分析仪器有限公司）。１３　菌体富集培养及菌种分离纯化从运行稳定的处理高浓度制药废水的ＢＡＦ反应器中取少量含生物膜的污水１６０ｒ／ｍｉｎ充分摇匀打碎，然后将其接种于富集培养基中，调ｐＨ为７．２～７．５，３０℃，１２０ｒ／ｍｉｎ培养１ｄ后，重复操作２～３次，作为备用菌液。用倍比稀释法将富集培养后的上层液分别稀释１０－７倍、１０－８倍和１０－９倍，涂布于ＢＴＢ初筛培养基平板上，３０℃倒置培养，直到长出肉眼可见的单菌落。选出长势良好，形态不同，且周围有蓝色晕圈的菌落，进行划线分离，直到平板上的菌落形态基本相同。将分离后得到的纯菌进行斜面保存。１４　形态观察和生理生化实验１）菌株形态学鉴定：对筛选的菌株进行革兰氏染色及电子显微镜观察。２）菌株生理生化鉴定：根据《常见细菌系统鉴定手册》［１２］（２００１）及《伯杰氏细菌手册（第八版）》［１３］进行。１５　细菌反硝化能力鉴定向灭菌后的反硝化培养基中按１％的量接入菌株Ｎ１，３０℃、１２０ｒ／ｍｉｎ摇床振荡培养，每隔２ｈ测定培养基中菌株Ｎ１在６００ｎｍ处的吸光度值，同时测定培养基中硝酸盐氮的变化情况及亚硝酸盐氮的累积量，以考察菌株Ｎ１在好氧条件下的反硝化特性。１６　１６犛狉犇犖犃的犘犆犚扩增和序列测定１）模板ＤＮＡ的提取：采用上海捷瑞生物工程有限公司的细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒（离心柱型）对好氧反硝化菌株Ｎ１进行ＤＮＡ提取。２）１６ＳｒＤＮＡ基因的ＰＣＲ扩增：以基因组ＤＮＡ为模板，扩增采用一对通用引物［１４１６］：正向引物Ｆ８：５’ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ３’（位置８～２７），反向引物Ｒ１４９２：５’ＣＴＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣ３’（位置１４９２～１５１２）。３）ＰＣＲ扩增的反应体系：全基因组扩增产物１μＬ，ＴａｐＤＮＡ聚合酶（ＴａＫａＲａ）０．２５μＬ，加水补足２５μＬ。４）ＰＣＲ扩增的反应条件：９５℃预变性５ｍｉｎ；９５℃变性３０ｓ，５４℃复性４５ｓ，７２℃延伸５ｍｉｎ，２５个循环；７２℃，１０ｍｉｎ。全基因组扩增的阴性对照用于９１１第１期张文艺，等：ＢＡＦ反应器中好氧反硝化菌的分子鉴定及分析同步实验。５）经ＰＣＲ反应扩增出１６ＳｒＤＮＡ，用上海捷瑞生物工程有限公司的ＤＮＡ快速回收试剂盒将ＰＣＲ产物进行纯化，以备测序。１７　１６犛狉犇犖犃序列分析及系统发育分析１６ＳｒＤＮＡ的全序列测定和分析：测序工作委托百奥迈科生物技术有限公司完成。测定序列与ＧｅｎＢａｎｋ上已发表的１６ＳｒＤＮＡ进行比对（ＢＬＡＳＴ），并将其在Ｃｌｕｓｔａｗ程序包中进行分析，最后形成一个多重序列匹配排列阵。用ＷＥＧＡ５程序包中的Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ程序，采用邻近法（ＮＪ法）计算进化距离，根据“Ｋｉｍｕｒａ２参数”方式，各分枝的重复性采用ＭＥＧＡ程序包中的Ｂｏｏｔｓｔｒａｐｍｅｔｈｏｄ程序分析，重复数为１５００，以确保系统进化树的可信度。２　结果与分析２１　好氧反硝化菌株的分离及形态观察用倍比稀释法将富集培养后的菌液分别稀释１０－７倍、１０－８倍和１０－９倍，涂布于ＢＴＢ初筛培养基平板上，３０℃恒温培养２～３ｄ后，挑取长势良好，形态不同，且周围有蓝色晕圈的菌落，进行多次划线分离纯化。并通过革兰氏染色与电子显微镜观察判断其是否为纯菌株及其菌体形态，最终分离出１株可在ＢＴＢ初筛培养基上生长良好的纯菌（命名为Ｎ１）。经形态观察，菌株Ｎ１在平板上培养２ｄ后，形成直径为２～５ｍｍ的圆形菌落，菌落表面光滑，隆起，呈浅黄色，边缘光滑；该菌株革兰氏染色呈阴性；电子显微镜观察显示，菌体呈杆状，无芽孢，如图１、图２所示。图１　菌株犖１在固体培养基上的菌落图２　菌株犖１镜检结果（４０×１０）２２　生理生化特性分析与１６犛狉犇犖犃测序由于各种细菌的新陈代谢类型不同，利用不同物质后产生的代谢产物有差异，因此细菌的生理生化反应成了细菌分类鉴定的主要依据。对菌株Ｎ１进行了常规的生理生