PCRDGGE研究亚硝化电化学生物反硝化全自养脱氮工艺细菌多样性

第６卷　第９期环境工程学报Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．９２０１２年９月ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＳｅｐ．２０１２ＰＣＲＤＧＧＥ研究亚硝化电化学生物反硝化全自养脱氮工艺细菌多样性柳栋升１，２　王海燕１　杨慧芬２　伊　静３　周岳溪１　张　娜１　庞朝辉１（１中国环境科学研究院水污染控制技术研究室，环境基准与风险评估国家重点实验室，北京１０００１２；２北京科技大学土木与环境工程学院，北京１０００８３；３中国矿业大学（北京），北京１０００８３）摘　要　采用分子生物学手段ＰＣＲＤＧＧＥ技术对亚硝化电化学生物反硝化全自养脱氮工艺细菌的多样性进行了研究。结果表明，亚硝化段内主要的细菌种群为相似于Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓｓｐ．（ＡＪ２２４４１０）和Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓｓｐ．ＮＭ４１（ＡＦ２７２４２１）的种群，相似性分别为９７％和９４％；电化学生物反硝化段细菌类群主要有βｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ类群、γｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ类群和Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ类群。填料上生物膜细菌种群较底部泥水混合物丰富，两者细菌种群相似性为７５％；底部泥水混合物样中存在与厌氧氨氧化菌Ｂｒｏｃａｄｉａａｎａｍｍｏｘｉｄａｎｓ（ＡＦ３７５９９４）相似性为９３％的菌种，而填料上生物膜中存在与Ｔｈｉｏａｌｋａｌｉｖｉｂｒｉｏｓｐ．Ｋ９０ｍｉｘ（ＥＵ７０９８６５）和Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｉｏｐａｒｕｓ（ＡＪ２４３１４４）相似性分别为９４％、９７％的菌种，其中Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｉｏｐａｒｕｓ（ＡＪ２４３１４４）是典型的硫自养反硝化菌，表明填料上生物膜中有大量的硫自养反硝化菌。关键词　ＰＣＲＤＧＧＥ　脱氮　亚硝化电化学生物反硝化　细菌多样性中图分类号　Ｘ１７２　　文献标识码　Ａ　　文章编号　１６７３９１０８（２０１２）０９３３４９０７ＢａｃｔｅｒｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｃｏｍｐｌｅｔｅａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｎｉｔｒｉｔｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｂｉｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｏｍｂｉｎｅｄｐｒｏｃｅｓｓｕｓｉｎｇＰＣＲＤＧＧＥＬｉｕＤｏｎｇｓｈｅｎｇ１，２　ＷａｎｇＨａｉｙａｎ１　ＹａｎｇＨｕｉｆｅｎ２　ＹｉＪｉｎｇ３　ＺｈｏｕＹｕｅｘｉ１　ＺｈａｎｇＮａ１　ＰａｎｇＺｈａｏｈｕｉ１（１ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＷａｔｅｒＰｏｌｌｕｔｉｏｎＣｏｎｔｒｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＲｅｓｅａｒｃｈＡｃａｄｅｍｙｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＣｒｉｔｅｒｉａａｎｄＲｉｓｋＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００１２，Ｃｈｉｎａ；２ＣｉｖｉｌａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＳｃｈｏｏｌ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｅｉｊｉｎｇ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８３，Ｃｈｉｎａ；３ＣｈｉｎａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭｉｎｉｎｇ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ　ＴｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｔｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｎｉｔｒｉｔｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｂｉｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｏｍｂｉｎｅｄｐｒｏｃｅｓｓｗａｓｓｔｕｄｉｅｄｂｙＰＣＲＤＧＧＥｍｅｔｈｏｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｄｏｍｉｎａｎｔｂａｃｔｅｒｉａｗａｓｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈｅＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓｓｐ．（ＡＪ２２４４１０）ａｎｄＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓｓｐ．ＮＭ４１（ＡＦ２７２４２１）ｉｎｎｉｔｒｉｔｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅａｃｔｏｒ．Ｔｈｅｄｏｍｉｎａｎｔｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｉｎｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｂｉｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅａｃｔｏｒｗｅｒｅβｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ，γｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａａｎｄＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ．Ｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｒｉｃｈｎｅｓｓｏｆｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｂｉｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅａｃｔｏｒｂｏｔｔｏｍｓｌｕｄｇｅｗａｓｓｌｉｇｈｔｌｙｍｏｒｅｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｐａｃｋｉｎｇｇｒａｎｕｌｅｂｉｏｆｉｌｍ．Ｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓｏｆｔｈｅｂｏｔｔｏｍｓｌｕｄｇｅａｎｄｇｒａｎｕｌｅｂｉｏｆｉｌｍｗａｓ７５％．Ｔｈｅａｎａｅｒｏｂｉｃａｍｍｏｎｉｕｍｏｘｉｄａｔｉｏｎｂａｃｔｅｒｉｕｍ，ｗｈｉｃｈｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｔｏＢｒｏｃａｄｉａａｎａｍｍｏｘｉｄａｎｓ（ＡＦ３７５９９４）ｗａｓ９３％，ｗａｓｆｏｕｎｄｉｎｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｂｉｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅａｃｔｏｒｂｏｔｔｏｍｓｌｕｄｇｅ．ＷｈｉｌｅｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓｔｏＴｈｉｏａｌｋａｌｉｖｉｂｒｉｏｓｐ．Ｋ９０ｍｉｘ（ＥＵ７０９８６５）ａｎｄＴｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｉｏｐａｒｕｓ（ＡＪ２４３１４４）ｗｅｒｅ９４％ａｎｄ９７％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｉｎｔｈｅｂｉｏｆｉｍ．Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｉｏｐａｒｕｓ（ＡＪ２４３１４４）ｗａｓｔｈｅｔｙｐｉｃａｌｓｕｌｆｕｒａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｂａｃｔｅｒｉａ，ｗｈｉｃｈｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔａｌａｒｇｅａｍｏｕｎｔｏｆｓｕｌｆｕｒａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｂａｃｔｅｒｉａｗａｓｉｎｔｈｅｐａｃｋｉｎｇｇｒａｎｕｌｅｂｉｏｆｉｌｍ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　ＰＣＲＤＧＧＥ；ｂａｃｔｅｒｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；ｎｉｔｒｉｔｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｂｉｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ基金项目：国家自然科学基金资助项目（５０７０８１２０）；甘肃省创新团队项目；国家“８６３”高技术研究发展计划项目（２００４ＡＡ６４９３２０）收稿日期：２０１１－０３－１４；修订日期：２０１１－０５－１９作者简介：柳栋升（１９８６～），男，硕士研究生，主要从事水处理原理与技术研究。Ｅｍａｉｌ：ｌｄｓ８７５５１６＠１６３ｃｏｍ通讯联系人，Ｅｍａｉｌ：[e-mail]　　变性梯度凝胶电泳（ｄｅｎａｔｕｒｅｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＤＧＧＥ）技术是目前研究环境微生物遗传多样性及种群动态变化的有效手段。该技术是ＤＮＡ指纹技术，可分辨出相同长度但碱基序列不同的ＤＮＡ片段，较于微生物的传统培养、富集，ＤＧＧＥ更能直接、可靠地反映微生物的原始组成。经过近环境工程学报第６卷十几年的发展，ＰＣＲＤＧＧＥ技术已广泛应用于土壤［１］、生物膜［２，３］、海洋［４］、活性污泥［５，６］等环境微生物生态学的研究。亚硝化电化学生物反硝化全自养脱氮工艺是本实验室已开发的针对低碳氮比废水处理的新工艺，该工艺主要是将进水氨氮控制在亚硝氮阶段，然后进入电化学通过硫／氢进行生物自养反硝化，从而达到脱氮目的。已研究当进水氨氮不高于１０００ｍｇ／Ｌ时，出水总氮去除率达９５％［７］，但对工艺内微生物细菌群落结构缺乏足够的认识，需进一步揭示其高效脱氮的原因。本研究采用分子生物学ＰＣＲＤＧＧＥ技术，对亚硝化电化学生物反硝化全自养脱氮工艺的细菌群落进行分析，以确定工艺内的优势类群，初步揭示亚硝化段、电化学生物反硝化段细菌群落结构特征，从而为工艺改进提供科学依据。１　实验部分１１　实验装置整个反应器由亚硝化段和电化学生物反硝化段组成。亚硝化段为连续流亚硝化膜生物反应器（ＭＢＲ）如图１（ａ）所示，亚硝化反应器由有机玻璃制成，长４８５ｍｍ、宽３００ｍｍ、高４５０ｍｍ，总体积４３Ｌ，有效体积为４０Ｌ。反应器采用连续流方式，底部由曝气泵经曝气头供气，用气体流量计调节供气量，用搅拌器进行泥水混合。图１　实验装置图Ｆｉｇ１　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅｑｕｉｐｍｅｎｔｓ　　电化学生物反硝化装置如图１（ｂ）所示。反应器长×宽×高为６７０ｍｍ×４００ｍｍ×２８４ｍｍ，总体积１０６Ｌ；反应器以不锈钢板做阴极，石墨板做阳极。阴极尺寸为４００ｍｍ×２７６ｍｍ×１ｍｍ，总面积为２４２８８ｃｍ２，阳极尺寸为４００ｍｍ×２７６ｍｍ×１０ｍｍ，电极间距２５ｍｍ。活性炭和硫磺颗粒按１∶１混合均匀作为填料。反应器有效体积４０Ｌ，电流由北京大华ＤＨ１７２０Ａ６型直流稳压电源提供。１２　样品采集和预处理实验运行至１７４ｄ，亚硝化段无机Ｃ／Ｎ比１２，温度为３５℃，溶解氧ＤＯ为０５ｍｇ／ｌ，ｐＨ为８２，水力停留时间ＨＲＴ２６５ｈ，电化学生物反硝化段温度为３０℃，ｐＨ为６７，电压３５Ｖ，电流１４Ａ，ＨＲＴ２５５ｈ，分别从亚硝化段和电化学生物反硝化段中采集污泥样Ｗ１、Ｗ２和Ｗ３，对上述样品进行ＤＧＧＥ分子实验研究。亚硝化段泥样制取：取亚硝化段泥水混合物约２００ｍＬ，沉淀１０ｍｉｎ，弃上清液，在１００００ｒ／ｍｉｎ条件下离心５ｍｉｎ，弃上清液得到样品污泥Ｗ１，在－２０℃条件下冷藏备用。电化学生物反硝化段泥样制取：从反应器底部取泥水混合物约２００ｍＬ，制取方法与亚硝化段泥样Ｗ１相同，得到的泥样为Ｗ２；用无菌刷从填料上制取适量生物膜后，边用无菌水冲洗，边用灭菌玻璃棒搅拌，沉淀３０ｍｉｎ，弃上清液，得到样品为Ｗ３。在－２０℃条件下冷藏备用。１３　实验方法１３１　细菌样品总ＤＮＡ的提取样品总ＤＮＡ的提取参照Ｚｈｏｕ等［８］的方法进行操作，并加以优化。ＤＮＡ提取物采用ＤＮＡ回收试剂盒纯化（北京鼎国公司），纯化后采用１％的琼脂０５３３第９期柳栋升等：ＰＣＲＤＧＧＥ研究亚硝化电化学生物反硝化全自养脱氮工艺细菌多样性糖凝胶电泳检测，置于－２０℃冰箱保存备用。１３２　ＤＮＡ片段的ＰＣＲ扩增采用由上海生工合成的细菌１６ＳｒＤＮＡ通用引物３４１Ｆ（５’ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ３’）和５３４Ｒ（５’ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ３’）直接对纯化后的ＤＮＡ片段进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ扩增体系为：ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（含ＴａＫａＲａＥｘＴａｑ１２５Ｕ／２５μＬ；ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ２×ｃｏｎｃ，各０４ｍｍｏｌ／Ｌ；ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ２×ｃｏｎｃ，４ｍｍｏｌ／ＬＭｇ２＋）２５μＬ，ＤＮＡ模板１μＬ，每种引物１μＬ（２０μｍｏｌ／Ｌ），最后加灭菌水至５０μＬ。ＰＣＲ反应条件为：９５℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性１ｍｉｎ，５８℃退火３０ｓ，７２℃延伸１５ｍｉｎ，３４个循环，７２℃最终延伸５ｍｉｎ。扩增产物用１％琼脂糖凝胶电泳检测。１３３　ＤＧＧＥ分析及测序采用Ｄｃｏｄｅ系统（美国ＢｉｏＲａｄ公司）进行ＤＧＧＥ分析，使用梯度混合器制备８％的丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度依次为４０％～６０％，上样量为３０μＬ，在１×ＴＡＥ电泳缓冲液中，６０℃条件下，２００Ｖ运行电泳６ｈ。电泳结束后，用０５μｇ／ｍＬ的溴化乙锭染色３０ｍｉｎ，然后在凝胶成像系统（美国ＵＶＰ公司）下观察电泳结果并照相。选择主要条带进行切胶，用５０μＬ无菌水浸泡所切条带１２ｈ以上，用不带ＧＣ夹子的正反引物进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ扩增产物经电泳确定为单一条带后送交生物公司（北京三博远志）纯化测序，测序结果提交ＧｅｎＢａｎｋ并获得接受号［９，１０］。１３４　丰富度和相关性分析为了解电化学生物反硝化段底部泥水混合物样品Ｗ２和填料上生物膜样品Ｗ３细菌种群的结构变化，分析讨论电化学生物反硝化段Ｗ２和Ｗ３细菌种