SMBBR工艺处理生活污水脱氮效能及其微生物多样性

《应用与环境生物学报》ChinJApplEnvironBiolDoi:10.19675/j.cnki.1006-687x.2018.04039SMBBR工艺处理生活污水脱氮效能及其微生物多样性*敬双怡1李岩1于玲红1**杨文焕1朱浩君1,2李卫平11.内蒙古科技大学能源与环境学院包头0140102.中丹康灵（北京）生物技术有限公司北京100085摘要微生物是生物膜法处理技术的核心，微生物多样性的研究对于生物膜法去除污染物的机理探讨具有重要意义。采用特异性流化床生物膜反应器（SpecialMovingBedBiofilmReactor，SMBBR）处理城市生活用水，并利用IlluminaHiSeq高通量测序技术对各反应器的微生物分布以及菌群与环境因子的相关性进行了研究。结果显示：在水温为20~30℃，上清液回流比为150%，DO为4mg/L，水力停留时间为18h的条件下，SMBBR对氨氮的去除率高达96.7%；SMBBR的好氧反应器和厌氧反应器的生物膜微生物种群结构组成存在不同，但优势微生物种群均为变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）。在属的水平检测到好氧反硝化菌红细菌（Rhodobacter）、陶厄氏菌属（Thauera），以及氨氧化细菌(Ammonia-oxidizingbacteria，AOB)亚硝化单胞菌（Nitrosomonadales）等。另外，DO是影响微生物群落结构最显著的环境因子。研究表明，环境因子会影响微生物群落替演，好氧反硝化以及氨氧化反应可能是SMBBR工艺中重要的脱氮机制。关键词特异性流化床生物膜法；高通量测序；微生物群落多样性；环境因子CLCX172AnalysisofDenitrificationEfficiencyofSMBBRProcessforDomesticSewageTreatmentandItsMicrobialDiversityJINGShuang-yi1,LIYan1,YULing-hong1**,YANGWen-huan,ZHUHao-jun1,2&LIWei-ping11.SchoolofEnergyandEnvironment,InnerMongoliaUniversityofScienceandTechnology,Baotou014010,China2.Sino-DanskeCloning(Beijing)BiologicalTechnologyCo.,Ltd,Beijing100085,ChinaAbstractMicroorganismisthecoreofbiofilmtreatmenttechnology,sothestudyofmicrobialdiversityisofgreatsignificancetothemechanismofremovingthepollutantsbybiofilmtreatmentmethod.Inthispaper,theSpecialMovingBedBiofilmReactor(SMBBR)wasusedtotreaturbandomesticsewage,andIlluminaHiSeqhigh-throughputsequencingtechnologywasusedtostudythemicroorganismdistributionandthecorrelationbetweenmicrofloraandenvironmentalfactorsineachreactor.Theresultsshowedundertheconditionsthatwatertemperatureis20~30℃,refluxratioofliquidsupernatantis150%,DOis4mg/L,thehydraulicretentiontime(HRT)is18h,removalrateofammoniaandnitrogenbySMBBRisashighas96.7%;thestructuresofbiofilmmicrobialpopulationinaerobicreactorandanaerobicreactorofSMBBRaredifferent,butthedominantmicrobialpopulationareProteobacteriaandFirmicutes.Aerobicanti-nitrifyingbacteriaRhodobacter,Thauera,andammonia-oxidizingbacteriaNitrosomonadalesweredetectedatthegenuslevel.Inaddition,DOwasthemostsignificantenvironmentalfactoraffectingthestructureofmicroflora.Theresultsshowedthatenvironmentalfactorsaffectedmicrobialcommunitysubstitution,aerobicdenitrificationandammoxidationmaybewereimportantdenitrificationmechanisminSMBBR.KeywordsSpecialMovingBedBiofilmReactor;High-Sequencing;Microbialcommunitydiversity;Environmentalfactors收稿日期Received:2018-04-25接受日期Accepted:2018-05-09*内蒙古科技大学产学研合作培育基金项目（PY-201401)资助SupportedbytheUniversity-ResearchCooperationIncubationFundfromtheInnerMongoliaUniversityofScienceandTechnologyIndustry**通信作者Correspondingauthor(E-mail:[e-mail])《应用与环境生物学报》ChinJApplEnvironBiolDoi:10.19675/j.cnki.1006-687x.2018.04039移动床生物膜反应器(MovingBedBiofilmReactor，MBBR)以其占地面积小、机制传质效率高、污泥产量少、微生物多样性丰富、管理操作方便等特点在国内外得到广泛的应用[1]。填料是MBBR的核心，它的性能直接决定了该工艺的挂膜能力、微生物生长情况以及污染物去除效果[2]。常见材料的填料例如碎石、炉渣、焦炭等，比表面积小，不易于微生物附着，天然材料的填料包括棉花、废报纸、小麦秸秆等则可能会带来氨、出水颜色等问题[3-9]。SDC-03型填料[10]是引进国外先进设计的蜂窝孔几何构型，由天然高分子材料（甘蔗渣）对不可降解的聚烯烃塑料进行改性制得的含有亲水性羟基的可降解塑料生物膜载体，其具有巨大的有效比表面积、比重更合理、亲水性好、微生物更易附着等特点。特异性移动床生物膜反应器（SpecialMovingBedBiofilmReactor，SMBBR）是在MBBR的基础上向反应器投加SDC-03型填料作为生物膜载体的生物处理技术。目前SMBBR已经被应用在低碳氮比生活污水、石油发酵工业废水、二辛酯（DOP）及高纯溶剂生产废水等中小型实验研究中，研究表明SMBBR在处理各类污废水时都表现出了超强的脱氮性能[11-13]，但尚不清楚SMBBR具体的脱氮机制。高通量测序技术以其通量高、速度快、成本低的优势而作为研究微生物多样性的强有力工具[14]，在环境微生物领域应用广泛，同时，该技术还被应用于鉴定水处理微生物的群落结构以及微生物多样性[15-17]。针对SMBBR脱氮机制的探讨，本文使用IlluminaHiSeq高通量测序技术研究了SMBBR稳定运行期反应器内填料上微生物种群结构及作用，探讨了微生物多样性指数和组间群落结构差异，分析了微生物与环境因子之间的关联，以期为SMBBR之后运行效果的提高提供一定的理论支持。1材料与方法1.1试验装置试验所用装置如图1所示，各反应器均由不锈钢钢材制成，呈长方体形，S1为好氧反应器，其有效容积为192.6L，A为厌氧反应器，其有效容积为183.6L，S2为好氧反应器的有效容积为345.6L。好氧反应器与厌氧反应器均设置沉砂池，沉砂池可以使沉淀过后的上清液流入下一个反应器，还可以排除剩余污泥。它的设置增大了原有池容的处理能力。好氧反应器配有曝气装置，厌氧反应器配有搅拌装置，转数为70r/min，试验初期采用快速排泥挂膜法挂膜，接种污泥取自包头市某污水厂的生化池，接种后最终MLSS为800mg/L，生物膜成熟后单个填料上的生物膜量可达0.4g。试验填料采用SDC-03型填料，各个反应器的填充比为30%[18]。好氧反应器的溶解氧（DO）控制在3mg/L，厌氧反应器的DO小于0.1mg/L，pH控制为6～9。图1试验装置示意图Fig.1Schematicdiagramoftheexperimentalequipment1.2样品来源及水质生物膜样品取自稳定运行期的SMBBR的各反应器以及妥善保存的接种污泥，第一个好氧反应器的样空气压缩机Aircompressor原水水箱Therawwatertank出水effluentS1AS2沉砂池Gritchamber沉砂池Gritchamber《应用与环境生物学报》ChinJApplEnvironBiolDoi:10.19675/j.cnki.1006-687x.2018.04039品标记为S1，厌氧反应器样品标记为A，第二个好氧反应器的样品标记为S2，接种污泥样品标记为J。原水采用城市生活用水，原水水质及稳定运行期间出水水质如表1所示，出水COD、氨氮、总氮均达到城镇污水处理排放的一级A标准。实验过程中主要的化学指标检测方法均参照《水和废水监测分析方法》。即COD采用重铬酸钾法；氨氮采用纳氏试剂分光光度法；总氮采用过硫酸钾消解紫外分光光度计法。表1SMBBR出水水质Table1EffluentwaterqualityofSMBBR指标IndexCODNH4+-NTN平均进水浓度Theaverageconcentrationofinfluent(ρ/mg·L-1)3006075平均出水浓度Theaverageconcentrationofeffluent(ρ/mg·L-1)19.81.989.8去除效率Removalrate(r/%)93.496.786.91.3高通量测序检测方法1.3.1生物膜采集及DNA提取采用超声波震荡使各反应器填料表面的生物膜脱落，而后放置在-20℃的条件下保存。使用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）对样本的基因组DNA进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。1.3.2PCR扩增及产物纯化使用无菌水将样品稀释至1ng/μl，以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物，NewEnglandBiolabs公司的Phusion®High-FidelityPCRMasterMixwithGCBuffer，和高效高保真酶进行聚合酶链式反应（PCR），确保扩增效率和准确性。引物采用16sRNA基因V3+V4区通用引物，引物序列为341F：5´-CCTAYGGGRBGCASCAG-3´和806R：5´-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3´。PCR仪的扩增反应体系（30μL）为PhusionMasterMix(2×)15μL，Primer(2μM)3mL(6μM)，gDNA(1ng/μL)10μL(5～10ng)。按照PCR反应条件（98℃1min，98℃10s，50℃30s，72℃30s，72℃5min）进行30个循环。然后根据PCR产物的浓度进行等量混样，充分混合后再使用2%的琼脂糖