常温ANAMMOX工艺运行性能及功能菌研究

中国环境科学2013,33(1)：56~62ChinaEnvironmentalScience常温ANAMMOX工艺运行性能及功能菌研究李冬1*,邱文新1,张男2,吴迪1,曾涛涛3,畅晓燕1,曾辉平1,张杰1,3(1.北京工业大学水质科学与水环境恢复工程北京市重点实验室,北京100124；2.国电东北环保产业集团有限公司仙女河污水处理厂,辽宁沈阳110005；3.哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150090)摘要：通过改变进水基质浓度,对以火山岩为填料的常温上向流厌氧氨氧化生物滤池在不同基质浓度下的脱氮性能进行了研究.借助显微镜、电镜(SEM)观察对滤池内的微生物形态进行了分析,利用变性凝胶电泳(DGGE)和克隆测序等微生物方法,对ANAMMOX种属进行了鉴定.试验结果表明,常温条件下,厌氧氨氧化滤池在高、低不同基质下都能够保持较高的脱氮效果,其中TN去除负荷最高能够达到2.99kgN/(m3⋅d),NH4+-N和NO2--N最高去除率分别能够达到99.4%和98.8%;显微镜、电镜观察显示:滤池下部的微生物种类更丰富,ANAMMOX菌在滤池的中部和上部的比例更高;16SrRNA克隆测序鉴定结果表明:滤池中的ANAMMOX菌为CandidatusKueneniastuttgartiensis,其对温度和基质浓度都有着较宽的适应性.关键词：厌氧氨氧化；自养生物脱氮；扫描电镜；变性凝胶电泳中图分类号：X703.1文献标识码：A文章编号：1000-6923(2013)01-0056-07StudyonperformanceofANAMMOXreactorandthefunctionalbacteriaatroomtemperature.LIDong1*,QIUWen-xin1,ZHANGNan2,WUDi1,ZENGTao-tao3,CHANGXiao-yan1,ZENGHui-ping1,ZHANGJie1,3(1.KeyLaboratoryofBeijingforWaterQualityScienceandWaterEnvironmentRecoveryEngineering,BeijingUniversityofTechnology,Beijing100124,China；2.GoudianDongbeiEnvironmentalProtectionIndustryGroupCo.,LtdXiannvheWasterwaterTreatmentPlant,Shengyang110005,China；3.StateKeyLaboratoryofUrbanWaterResourceandEnvironment,HarbinInstituteofTechnology,Harbin150090,China).ChinaEnvironmentalScience,2013,33(1)：56~62Abstract：Atroomtempertature,bychangingthesubstrateconcentrationofinflow,thebiologicalnitrogenremovalofup-flowingANAMMOXbiofilterloadingvolcanicrockfilteratdifferentammoniumconcentrationswasinvestigated.techniquesofmicroscopeandscanningelectronmicroscopy(SEM)wereutilizedtoanalyzemicroorganismsform,denaturinggradientgelelectrophoresis(DGGE),cloningandsequceningwereusedtoidentifyspeciesofANAMMOX.Theresultsofoperationrevealedthat,atroomtemperature,theup-flowANAMMOXbiofilterhadtheabilitytomaintainhighcapacityofbiologicalnitrogenremovalunderhighandlowsubstrateconcentrations.Themaximumtotalnitrogenremovalloadwasupto2.99kgN/(m3⋅d),andthemaximumremovalrateofNH4+-NandNO2--Nwas99.4%and98.8%respectively.MicroscopeandSEMshowthatthespeciesofmicroorganismsismuchricheratthebottomofbiofilter,however,theproportionofANAMMOXismuchhigherinthemiddleandupperofbiofilter.ThesequenceofANAMMOX16SrRNAidentificationrevealedthatCandidatusKueneniastuttgartiensisoccurredintheup–flowingANAMMOXbiofilter,whichhadwideadaptabilitytodifferenttemperatureandsubstrateconcentrations.Keywords：anaerobicammoniumoxidation；autotrophicbiologicalnitrogenremoval；scanningelectronmicroscopy；denaturinggradientgelelectrophoresis厌氧氨氧化(ANAMMOX)是以NO2--N为电子受体,以CO2为主要无机碳源,在缺氧情况下,将NH4+-N氧化成N2的生物反应过程[1].相比较传统工艺,ANAMMOX工艺具有污泥产量少,无需曝气、无需外加有机碳源等优点.在自然界中,ANAMMOX菌分布非常广泛,并且对于温度、收稿日期：2012-04-18基金项目：教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-10-0008);国家科技重大专项-水专项(2012ZX07202-005);北京工业大学第九届研究生科技基金项目(ykj-2011-4764)(ykj-2011-4765)(ykj-2011-4766)*责任作者,教授,[e-mail]1期李冬等：常温ANAMMOX工艺运行性能及功能菌研究57盐度以及基质浓度都有着较宽的适应性[2-4].但是现阶段ANAMMOX成功的工程应用案例还仅限于处理污泥消化上清液、制革废水以及垃圾渗滤液等高温高氨氮废水.ANAMMOX工艺如果能够在更低的温度和基质浓度下保持高效的脱氮性能,完全可以运用于常温低氨氮污水[5-6].本试验考察了接种ANAMMOX菌启动的上向流厌氧氨氧化生物滤池在常温,高、低不同基质下的脱氮性能;对此运行条件下ANAMMOX菌数量和活性沿滤池高度的分布情况,微生物形态进行了分析;并对ANAMMOX菌种属进行了鉴定,以探索ANAMMOX工艺用以处理常温低氨氮污水的可行性.1材料与方法1.1实验装置试验装置如图1所示,由有机玻璃制成,内径185mm,高2.0m,总容积45.7L,有效容积17.4L.底部设有50mm的河卵石承托层,柱内装填平均粒径为2~3mm火山岩,装填高度1.8m,滤池壁上每100mm设有一个取样口,水流方向为上向流,最上端设有一个出水口.1.2实验方案和用水直接接种在高基质浓度下培养的ANAMMOX菌[7].接种前,原有的ANAMMOX生物滤池总氮去除负荷为2.44kgN/(m3⋅d).实验在常温T(18.5~24.4℃),pH7.25~7.70下,采用高基质低流量的运行方式对其启动,启动成功后按照氨氮:亚硝酸盐=1:1.3的方式逐步降低进水总氮的浓度,最终由高基质、低流量转为低基质、高流量下运行.实验用水采用人工配水的方式,用自来水以1:1.3配制(NH4)2SO4、NaNO2,每次配水总体积为1415L,同时外加10L左右的A/O二级出水[8].实验室测得在25℃下自来水中的溶解氧为6~8mg/L,且试验过程中没有溶解氧的吹脱,会造成部分NO2--N氧化成NO3--N.主要运行状况和进水水质指标如表1所示.1239265出水78进水进水图1试验装置Fig.1Schematicdiagramoftheexperimentalequipment1.水箱2.阀门3.蠕动泵4.承托层5.滤料层6.取样口7.出水口8.探头9.在线监测仪表1主要运行工况和进水水质指标Table1Themainrunstatusandtheindexofinfluentwatercharacteristics阶段时间(d)HRT(h)NH4+-N(mg/L)NO2--N(mg/L)NO3--N(mg/L)启动阶段0~581.54~1.16156.8~223.8204.6~309.011.3~24.5降基质阶段59~951.16~0.5979.2~170.5114.6~227.54.1~10.6第一低基质运行阶段96~1400.59~0.5379.1±5.2106.8±7.55.8±1.8第二低基质运行阶段141~1700.53~0.3645.8±7.967.8±6.45.8±3.41.2分析方法1.2.1常规项目分析方法水样分析项目测定中NH4+-N采用纳氏试剂光度法,NO2--N采用N-(1-萘基)乙二胺光度法,NO3--N采用紫外分光光度法[9];pH值及水温的测定采用WTWpH/Oxi340i手提式pH、溶解氧试仪.1.2.2微生物分析方法从反应器滤层上、中、下部位的滤料表面取生物膜,进行革兰氏染色,采用普通光学显微镜油镜放大1000倍对微生物进行观察.另外,还对生物膜进行扫描电镜观察:取生物膜0.5g,戊二醛固定4h(4℃,2.5%,pH7.8),磷酸缓冲溶液(PBS,0.1mol/L)水洗3次,每次10min;58中国环境科学33卷用30%,50%,70%,90%,无水乙醇脱水,每次15min;通过无水乙醇、乙酸异戊酯为1:1的溶液置换,及乙酸异戊酯再一次置换,每次15min;真空干燥,喷金,扫描电镜观察.DGGE、克隆测序试验方法:在反应器滤层上、中、下部位分别取200mL含生物膜的水样,12000×g,4℃离心10min,收集生物膜沉淀,进行细菌总DNA提取.PCR引物采用Amx368-GC和Amx820,特异性扩增ANAMMOX菌16SrDNA基因.PCR反应体系的组成为:总细菌DNA模板1.0µL,10×Buffer2.5µL,dNTPs(2.5mmol/L)2.0µL,Amx368-GC引物和Amx820引物(10µmol/L)各1.0µL,ExTaq酶(5U/µL)0.125µL,补水至终体积为25µL.PCR扩增条件为:94℃,5min;94℃,40s,55℃,40s,72℃,1min,35个循环;72℃,10min.PCR纯化回收产物通过D-CodeSystem(Bio-Rad公司)进行DGGE电泳.电泳条件:8%聚丙烯酰胺凝胶浓度,变性梯度范围为30%~60%,电泳缓冲液为1×TAE,温度60℃,120V电压下电泳8h.电泳结束后,凝胶进行银染,通过数码相机获取图像[10].对厌氧氨氧化DGGE凝胶上条带进行切胶溶于100µL1×TE中,4℃,16h.以此为模板,相应不带GC夹的BSF338/BSR518及Amx368/Amx820为引物,扩增细菌及ANAMMOX菌16SrRNA片段.将纯化回收的PCR产物连接到载体pMD19-T(TaKaRa)上,并转化到感受细胞EscherichiacoliDH5a(TA天根,中国)中.阳性克隆送交上海生工生物公司(中国)进行测序.2结果与讨论2.1厌氧氨氧化生物滤池脱氮