超滤法脱除猫爪草粗多糖中蛋白质的工艺研究廖启元

超滤法脱除猫爪草粗多糖中蛋白质的工艺研究廖启元，经嘉，王晓阁，刘东平，刘丽敏（安徽中医药高等专科学校，安徽芜湖241000）摘要：研究了超滤法脱除猫爪草粗多糖中蛋白质的工艺.以多糖保留率和蛋白脱除率为评价指标，考察了截留分子量、温度、压力、多糖浓度、时间对超滤效果的影响.当选用截留分子量（MWCO）30000、温度25℃、压力0.10MPa、多糖的浓度3.0mg/mL时，超滤处理100min，多糖保留率和蛋白脱除率分别为78.2%和77.1%，优于Sevag法和TCA法.超滤法是一种可行的脱除猫爪草粗多糖中蛋白质的方法.关键词：猫爪草；多糖；脱蛋白；超滤中图分类号：R91文献标识码：A文章编号：1671－9743（2018）05－0004－05收稿日期：2018-03-08基金项目：安徽省教育厅重点项目“猫爪草多糖的提取分离及抗炎作用研究”（KJ2016A420）.作者简介：廖启元，1979年生，男，湖北武汉人，讲师，研究方向：药学.猫爪草（RanunculusternatusThunb）又称小毛茛、三散草，是毛茛科毛茛属一年生草本植物，1977年收载于《中华人民共和国药典》[1].研究表明，猫爪草具有抗肿瘤、抗菌、调免疫、抗氧化等作用[2]，多糖为其重要活性成分之一[3].目前，已有文献报道猫爪草多糖的水提醇沉工艺[4]，但所得多糖含有大量蛋白杂质，需进行脱蛋白处理加以纯化.超滤是一种新兴高效的膜分离技术，在切向流过程中，大分子溶质随溶液切向流经膜表面，而小分子物质和溶剂则在压力驱动下穿过超滤膜致密层上的微孔而进入膜另一侧，从而实现不同分子量物质的分离[5].猫爪草粗多糖中，多糖与杂蛋白虽均为大分子物质，但两者分子量有所差异.基于此，本文研究了利用超滤法脱除猫爪草粗多糖中蛋白杂质的工艺，以期探索一种更为简单有效的植物多糖脱蛋白方法.1材料与方法1.1试验材料猫爪草材料购于安徽亳州中药材市场，经安徽中医药高等专科学校汪荣斌教授鉴定为毛茛科植物猫爪草；FA1204N型电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；RE5298A旋转蒸发仪（西安禾普生物科技有限公司）；UV-1800型紫外可见分光光度计（上海翱艺仪器有限公司）；DZKW-S-4电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器有限公司）；PHS-25型pH计（上海今迈仪器仪表有限公司）；80-2B离心机（湖南星科科学仪器有限公司）；Vivaflow50及配件（德国sartorius公司）；BT-100恒流泵（上海沪西分析仪器有限公司）；DF-101S集热式磁力搅拌器（上海越众仪器设备有限公司）；葡萄糖、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G250、浓硫酸、苯酚、无水乙醇、氢氧化钠、双氧水（质量浓度30%）等试剂均为分析纯.1.2试验方法1.2.1猫爪草粗多糖的提取及脱色称取猫爪草500g，粉碎过24目筛，粉末用石油醚回流脱脂3次，每次6h.挥去石油醚后加20倍量水，于90℃提取2次，每次2h.离心合并上清液，减压浓缩至500mL，加入4倍体积无水乙醇，冷藏过夜.离心收集沉淀、干燥，得猫爪草粗多糖.加蒸馏水复溶至多糖浓度约为1.0mg/mL作待脱色液.将待脱色液按pH9.0、温度45℃、双氧水用量20%的条件脱色60min，而后减压浓缩，用0.45μm微孔滤膜过滤，调整多糖浓度作超滤原料液备用.1.2.2超滤方法按照图1所示，连接超滤装置及附件，超滤过程中不断补充等温的蒸馏水，保持原料液体积维持不变.1.2.3多糖含量测定-苯酚硫酸法[6]1.2.4蛋白质含量测定-考马斯亮蓝法[7]1.2.5多糖保留率的计算第37卷第5期2018年5月怀化学院学报JOURNALOFHUAIHUAUNIVERSITYVol.37.No.5May，2018DOI:10.16074/j.cnki.cn43-1394/z.2018.05.002多糖保留率=保留液中多糖质量原料液中多糖质量×100%1.2.6蛋白脱除率的计算蛋白脱除率=原料液中蛋白质量-保留液中蛋白质量原料液中蛋白质量×100%2结果与分析2.1超滤膜的选择取原料液300mL，调整多糖浓度为1.0mg/mL，温度15℃、超滤压力0.10MPa，分别选择截留分子量（MWCO）为10000、30000、50000、100000的Vivaflow50型超滤膜进行脱蛋白处理.当透过液达300mL时结束超滤，考察不同截留分子量对脱蛋白效果的影响，结果如表1所示.由表1可知，随着超滤膜的截留分子量逐渐增加，超滤时间不断减少，对应的平均通量迅速提高.当选用MWCO10000时，多糖的保留率为87.6%，此时蛋白脱除率为75.6%，脱蛋白效果较好，但效率较为低下.当选用MWCO30000时，多糖的保留率为76.7%，蛋白脱除率为77.3%，相比于MWCO10000时脱蛋白效果多糖保留率有所降低，但耗时从337min减少至99min，效率大大提高.选用MWCO50000和MWCO100000时，蛋白脱除率分别为72.2%与65.6%，且多糖保留率均较低，分别为67.5%与61.3%.综合考虑效率及蛋白脱除效果，应选择MWCO30000.贾慧青[8]通过氨基柱和DEAE-纤维素柱从猫爪草粗多糖中分离出了3种均一多糖，分子量分别为8800、9790和23150；陈彦[9]采用DEAE-Cellulose-52和Superdex200柱色谱从猫爪草中分离出了一种均一多糖，分子量为24000；吴晓[10]利用DEAE-纤维素柱从猫爪草粗多糖中分离出了2种均一多糖，重均分子量分别为58200和47000.本试验表明，猫爪草多糖的分子量极可能高于10000.2.2温度对超滤效果的影响取原料液300mL，调整多糖浓度为1.0mg/mL，超滤压力0.10MPa，选用MWCO30000超滤膜进行脱蛋白处理.当透过液达300mL时结束超滤.考察超滤温度对脱蛋白效果的影响，结果如图2所示.由图2可知，随着温度的增加，多糖保留率和蛋白脱除率起初几乎保持不变，温度超过30℃后多糖保留率从76.2%增加至88.2%，但蛋白脱除率从77.6%迅速降低至52.7%，平均通量的变化过程为先增加后降低.温度对超滤的影响较为复杂，一方面温度增加，原料液的粘度降低，利于原料液中各组分的扩散及在膜表面的流动，减缓浓差极化；另一方面，温度的增加使得超滤膜膨图1超滤装置连接图表1不同截留分子量超滤膜脱蛋白的结果MWCO多糖保留率/%蛋白脱除率/%超滤时间/min平均通量/（mL/cm2·min）1000087.675.63370.0183000076.777.3990.0605000067.572.2710.08410000061.365.6410.146廖启元，等：超滤法脱除猫爪草粗多糖中蛋白质的工艺研究第37卷第5期·5·胀变形，膜孔径减小，不利于超滤，且较高的温度使膜的寿命变短.因此，结合控温能耗及效率，综合分析后选择超滤温度为25℃.2.3压力对超滤效果的影响取原料液300mL，调整多糖浓度为1.0mg/mL，超滤温度25℃，选用MWCO30000超滤膜进行脱蛋白处理，当透过液达300mL时结束超滤，考察操作压力对脱蛋白效果的影响，结果如图3所示.由图3可知，多糖保留率先随操作压力的提高不断降低，当压力超过0.20MPa后多糖保留率开始缓慢增加.而蛋白脱除率先先随操作压力的提高不断增大，当压力超过0.20MPa后蛋白脱除率开始降低.超滤的动力来源于压力差，在较低的压力范围内提高操作压力可增加通量，但压力过大时，浓差极化变得更加严重，且胶状大分子受压变形堵塞膜孔，缩短膜的使用时间.综合考虑，为延长超滤膜的使用寿命，应选择较低的操作压力0.10MPa进行处理脱蛋白.2.4多糖浓度对超滤效果的影响取原料液300mL，设置超滤温度25℃，操作压力0.10MPa，选用MWCO30000超滤膜进行脱蛋白处理，当透过液达300mL时结束超滤，考察多糖浓度对超滤效果的影响，结果如图4所示.由图4可知，多糖浓度密切影响超滤效果.当多糖浓度从1.0mg/mL增加至3.0mg/mL，多糖保留率缓慢增加，蛋白脱除率保持不变.当多糖浓度从3.0mg/mL增加至5.0mg/mL时，多糖保留率迅速增加从78.9%至83.9%，而蛋白脱除率从77.5%减少至68.7%.可能原因是超滤过程中，随着溶液浓度升高，粘度亦不断增加，不图2温度对超滤效果的影响图3压力对超滤效果的影响怀化学院学报2018年5月·6·表2不同脱蛋白方法的结果对比方法多糖保留率/%蛋白脱除率/%超滤法78.277.1Sevag法55.365.7TCA法50.470.2利于超滤.此外，多糖和蛋白等大分子物质对膜均有一定吸附性且多糖的吸附性更强，浓度升高时在膜表面吸附的大分子物质不断增加，甚至产生变形，加剧了膜的堵塞，阻滞了多糖和蛋白透过超滤膜.因而，选择控制超滤原料液中多糖的浓度为3.0mg/mL.2.5时间对超滤效果的影响取原料液300mL，调整操作压力0.10MPa，超滤温度25℃，多糖浓度为3.0mg/mL，选用MWCO30000超滤膜进行脱蛋白处理，考察超滤时间对超滤效果的影响，结果如图5所示.由图5可知，多糖保留率随超滤时间的延长不断降低，蛋白脱除率则不断提高.但当超滤时间超过100min后，多糖保留率与蛋白脱除率几乎保持不变.结合效率及脱蛋白效果考虑，应选择超滤时间为100min.此时，多糖保留率为78.9%，蛋白脱除率为77.5%.由以上单因素分析可知，超滤法对猫爪草粗多糖脱蛋白的工艺条件可选为：截留分子量（MWCO）30000、温度25℃、操作压力0.10MPa、多糖的浓度3.0mg/mL、时间为100min.2.6多种脱蛋白方法的比较取原料液3份，每份300mL，调整多糖浓度为3.0mg/mL.按文献[11-12]的条件参数，分别采用Sevag法和TCA（三氯乙酸）法脱蛋白处理，与超滤法进行对比，结果如表2所示.由表2可知，超滤法的多糖保留率为78.2%，蛋白图4多糖浓度对超滤效果的影响图5时间对超滤效果的影响廖启元，等：超滤法脱除猫爪草粗多糖中蛋白质的工艺研究第37卷第5期·7·RemovalProteinofRanunculusTernatusThunbCrudePolysaccharidebyUltrafiltrationLIAOQi-yuan，JINGJia，WANGXiao-ge，LIUDong-ping，LIULi-min（AnhuiCollegeofTraditionalChineseMedicine，Wuhu，Anhui241000）Abstract：RemovalofproteinofRanunculusternatusThunbcrudepolysaccharidebyultrafiltrationwasstudied.Withtheretentionrateofpolysaccharideandremovalrateofproteinastheindex，molecularweightcutoff（MWCO），temperature，pressure，concentrationofthepolysaccharideandtimeswereexplored.Theoptimalconditionwereasfollows：MWCO30000，45℃，0.10MPa，3.0mg/mLofthepolysaccharideand100min，retentionrateofpolysaccharideandremovalrateofproteinwere78.2%and77.1%，respectively，whichwasbetterthanSevagandTCA.ItisfeasiblethatremovalofproteinofRanunculusternatusThunbcrudepolysaccharidebyultrafiltration.Keywords：RanunculusternatusThunb；polysac