低温产甲烷菌分离鉴定及发酵产气初步研究

分类号：Q939.97密级：学号：2009118011单位代码：10759石河子大学硕士学位论文低温产甲烷菌分离鉴定及发酵产气初步研究学位申请人张硕指导教师鲁建江副教授申请学位门类级别工学硕士学科、专业名称生物化工研究方向废弃物资源化利用及过程控制所在学院化学化工学院中国·新疆·石河子2012年6月IsolationandidentificationofamphipsychrophilicmethanogenandpreliminarystudyoftheanaerobicfermentationADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofEngineeringByZhangShuo(Biochemicalengineering)DissertationSupervisor:Prof.LuJian-JiangJune,2012石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：年月日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日低温产甲烷菌分离鉴定及发酵产气初步研究I摘要新疆生物质资源丰富但冬季气温低，致使沼气池发酵产气量下降，有时甚至停止产气不能满足人们对于稳定供气的需要，沼气工程大规模推广也受到限制。厌氧发酵核心是产甲烷菌分解小分子底物产甲烷过程。因此使用厌氧分离技术从各种极端环境分离筛选获得耐低温兼性嗜冷产甲烷菌种，扩大培养后投入到低温沼气池是改善低温厌氧发酵的一种重要途径。研究菌株生长特性和其生物学特征，并结合系统发育分析确定产甲烷所属种属。研究结果如下：通过从耐低温沼气池和湖底采集污泥样品，厌氧条件下分离获得两株产甲烷菌菌株SZ-1和SZ-2，荧光相差显微镜观察都为不含杂菌纯产甲烷菌菌株。后经耐低温和常温发酵实验筛选，SZ-2菌株符合兼性耐低温且常温也能良好产气要求。通过对SZ-2菌株显微观察，菌株呈八叠球状，菌体聚集形成假胞体，不规则裂殖。SZ-2菌株接种到固体培养基中15℃厌氧低温恒温培养10天长出菌落，菌落呈黄色，不规则，且边缘整齐。生理特征研究：菌株15～30℃范围内产气效果良好，25℃为SZ-2菌株最适生长温度；初始发酵液环境pH值为6时最适宜SZ-2菌株生长产气量最大，SZ-2菌株生长的氯化钠浓度范围为0～0.4mol/L,0.2mol/L时产气量最大。SZ-2菌株能够利用H2/CO2、甲醇、甲胺、二甲胺、三甲胺作为单一碳源底物进行厌氧发酵代谢产生甲烷；不能耐受链霉素和卡那霉素。SZ-2菌株厌氧条件产甲烷菌保藏实验表明：SZ-2进行短期保存时，温度控制在低温零度且添加足够营养厌氧保存最长时间2个月后菌种复活仍有活力。SZ-2菌株长期保藏，采用改进厌氧甘油低温冷冻保藏法，SZ-2菌株保藏6～8月时就应进行传代。通过对SZ-2菌株16SrDNA进行扩增后连接质粒，送交测序；经过同源比对和系统发育分析确定SZ-2菌株属于甲烷八叠球菌属菌株（Methanosarcina），并与巴氏甲烷八碟球菌种菌株亲缘关系较近。结合菌株形态学、结构特征、生理生化特性，SZ-2菌株为一株耐低温驯化后的兼性嗜冷巴氏甲烷八叠球菌。SZ-2菌株扩大培养后投入到模拟发酵瓶装置中，厌氧发酵秸秆和牛粪混合物，发酵产气量和发酵启动时间都得到提高。关键词：产甲烷菌；系统发育分析；厌氧发酵；低温厌氧发酵低温产甲烷菌分离鉴定及发酵产气初步研究IIAbstractBiomassresourcesinXinjiangisrich,whereaslocalclimateinwintercouldcausethedeclineofbiogasproduction,anaerobicfermentationevenstoptoruninthissituation,sothestablesupplyofbiogasalsobedestroyed,anditslargescalepromotionislimited.Themetabolismofmethanogensisthecoreofanaerobicfermentation,amajorwaytoimprovethelow-temperatureanaerobicfermentationistoisolateandscreenamphipsychrophilicmethanogenfromdifferentextremeenvironments,theisolatedstrainbeenrichedandthenaddtootherdigesterwillsignificantlyimprovelow-temperatureanaerobicfermentation.Atthesametime,thegrowthandbiologicalcharacteristicsandPhylogeneticanalysiswerestudiedtotheisolatedstrains.Theresultsasfollow:twostrainsofSZ-1andSZ-2wereisolatedfromlake‟ssedimentsandoverwintereddigesterbyanaerobicseparationtechnology,twostrainsallpuremethanogenwerecheckedbyfluorescencephasecontrastmicroscope.SZ-2strainsisinlinewiththeamphipsychrophilicscreeningrequirements.SZ-2iseightstackedspherical,aggregatedtoformfalsecellbody,Irregularschizont,anditscolonieswereyellow,irregular,andneatedge.Physiologicalcharacteristics:SZ-2coulduseH2/CO2,methylamine,dimethylamine,trim-ethylamine,methanolasthesubstrate.Theoptimaltemperatureis25℃,15~30℃isallsuitablegrowth,andtheoptimalpHis6.0,andNa+concentrationis0~0.4mol/L.SZ-2couldtoleratemanyantibioticexceptstreptomycinandkanamycin.SZ-2preserved:Under0℃absolateanaerobicsituationwithenoughnutrition,SZ-2isalsovitalityafterbeshort-timepreserved.Thelong-preservationwas6~8monthmusttosubculturethatusedmodifiedglycerolcryogenicpreservation.The16SrDNAgeneofSZ-2wasPCRamplified,andblasten.StrainSZ-2ismethanosarinajudgedbythehomologyandphysiologicalcharacteristics,andwithphylogeneticanalysisshowedthatit‟sanamphipsychrophilicbarkerimethanosarcina.StrainSZ-2wereamphiliedcultureandthenaddedintosimulatedanaerobicfermentation,strawandcowdungmixtureassubstract,biogasproductionandfermentationstart-uptimehavebeenimproved.Keywords:methanogen,phylogeneticanalysis,anaerobicfermentation,low-temperatureanaerobicfermentation低温产甲烷菌分离鉴定及发酵产气初步研究III目录摘要...........................................................................................................................................IABSTRACT..............................................................................................................................II第一章文献综述........................................................................................................................11.1沼气发酵意义及存在问题..............................................................................................11.2厌氧发酵..........................................................................................................................21.2.1沼气厌氧发酵代谢途径...........................................................................................21.2.2温度对于厌氧发酵的影响.......................................................................................31.2.3低温产甲烷菌国内外研究进展...............................................................................41.3产甲烷菌特征..................................................................................................................51.3.1产甲烷菌的生物学特征...........................................................................................51.3.2产甲烷菌的分离鉴定............................