第九章高效液相色谱法

1第一节概述第二节高效液相色谱仪第三节固定相和流动相第四节高效液相色谱法的主要类型及选择第九章高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC2高效液相色谱法（HPLC）是一种新型分离分析技术，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：第一节概述31．高效液相色谱法与经典液相色谱法高效液相色谱法：高速、高效、高灵敏度、高自动化。配备了高压输液设备，高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。经典液相色谱：重力加料，流出速度极慢；对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。4HPLC特点：高压、高效、高速高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。HPLC经典液相色谱52．高效液相色谱法与气相色谱法（l）分析对象GC：气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。HPLC：对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质。(2)流动相GC：惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。HPLC：不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。6(3)操作温度GC：一般都在较高温度下进行的，HPLC：经常可在室温条件下工作。总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。7第一节概述第二节高效液相色谱仪第三节固定相和流动相第四节高效液相色谱法的主要类型及选择第九章高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC8第二节高效液相色谱仪高效液相色谱仪的结构示意见下图，一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。9液相色谱仪10高效液相色谱流程11原因：由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。最重要的部件，包括储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等，其中高压输液泵是核心部件。高压输液泵的要求：密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。恒压泵：是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差，它们各有优缺点。恒流泵：是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。1.高压输液系统12往复式柱塞泵13梯度淋洗装置将两种或以上不同极性的溶剂按一定的比例混合，改变色谱柱中流动相的极性，离子强度等，从而改变被测组分的相对保留值，提高分离效率。2.附属系统它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高效液相色谱仪中尤为重要的附属装置.14外梯度（高压梯度）:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度（低压梯度）:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。153．进样系统高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。16进样装置流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：174．分离系统——色谱柱重要组件之一。柱体为直型不锈钢管，内壁抛光。柱内填充极细的固定相。管径大小影响柱效，应避免谱峰扩宽。内径4～5mm，柱长10～50cm。固定相的填充分干法（粒径大于20微米）和湿法（小于20微米）两种。湿法，即匀浆法。发展趋势是减小填料粒度以提高柱效。18一般在色谱柱前备有一个前置柱，前置柱内填充物和色谱柱完全一样，这样可使流动相由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过色谱柱时不再洗脱其中固定相，保证色谱柱的性能不受影响。前置柱195．检测系统溶质性检测器对被分离组分的物理或化学特性有响应，有紫外、荧光、电化学检测器等。总体检测器对被分离组分和流动相总的物理或化学性质有响应，有示差折光、电导检测器等。现将常用的检测器介绍如下:20（1）紫外检测器应用最广，HPLC分析中，约有80%的样品适用。•工作原理：被分析试样对特定波长的紫外光有选择性吸收（定性分析）；•试样浓度与吸光度的关系服从比尔定律（定量分析）21紫外检测器特点1.灵敏度高，最小检测浓度可达10-9g/ml,也适用于对紫外光吸收很弱的物质的检测；2.对流动相的流速和温度变化不敏感；3.线形范围宽；4.结构简单，流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；5.可用于梯度淋洗。缺点不能检测无紫外吸收的试样；流动相的选择受限,即流动相无紫外吸收或在被测组分的波长处无吸收。22（1）a.紫外光电二极管阵列检测器UVDiodeArrayDetector,DAD紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，还可以作出任意波长的吸光度-时间曲线（色谱图）任意波长的吸光度-波长曲线（紫外吸收光谱图）2324紫外普通检测器和光电二极管阵列检测器的比较普通检测器光电二极管阵列检测器25（2）荧光检测器fluorescencedetector利用某些试样具有荧光特性进行检测。许多有机物具有天然荧光活性：芳香基团化合物。对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应.优点：高灵敏度、高选择性缺点：适用范围有局限性。26(3)示差折光检测器differentialrefractiveindexdetector除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度淋洗；偏转式、反射式和干涉型三种；27第一节概述第二节高效液相色谱仪第三节固定相和流动相第四节高效液相色谱法的主要类型及选择第九章高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC28第三节高效液相色谱的固定相和流动相－.固定相以承受高压能力来分类：刚性固体：以二氧化硅为基质，可承受7.0×108～1.0×109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶：主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。291.表面多孔型固定相组成：基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。特点：多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。缺点：由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。302．全多孔型固定相组成：由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。也可由氧化铝微粒凝聚成全多孔型固定相，特点：由于颗粒很细（5～10μm），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。31二.流动相如何正确选择流动相？对流动相溶剂的要求是：（1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。（2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用溶剂的紫外截止波长比检测器波长要短。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。下表列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。3233（3）高纯度。由于高效液相法灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50～1OOnm。（4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。（5）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙腈等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离.34第一节概述第二节高效液相色谱仪第三节固定相和流动相第四节高效液相色谱法的主要类型及选择第九章高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC35一、液-固吸附色谱二、液-液分配色谱三、离子交换色谱四、离子色谱五、离子对色谱六、排阻色谱七、亲和色谱第四节高效液相色谱法的主要类型及选择36一、液-固吸附色谱固定相：固体吸附剂,如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；37二、液-液分配色谱固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相normalphase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相reversephase）。正相与反相的出峰顺序相反；固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。38化学键合固定相类型化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：≡Si—O—Cb.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—C稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；c.硅碳键型：≡Si—Cd.硅氮键型：≡Si—N39化学键合固定相的特点（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱；存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理),高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；40三、离子交换色谱固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。41离子交换色谱42四、离子色谱离子色谱是在20世纪70年代中期发展