第六章亲和分离技术

第六章亲和分离技术生物大分子之间的特异性结合作用称为生物亲和作用（bioaffinity），简称亲和作用，如抗原与抗体、酶与酶原（或抑制剂、底物）、核酸与互补碱基链等。利用亲和作用纯化生物大分子的生化分离技术称为亲和分离技术，它是基于固定相的配基与生物分子间的特殊生物亲和能力的不同来进行相互分离的。第一节亲和技术发展1910年有人发现不溶性淀粉可以选择性吸附生物组织抽提液中的α-淀粉酶，这是亲和分离法的最初应用及报道。1951年Campbell等利用半抗原（对氨苯甲基）修饰纤维素制备的载体为亲和吸附介质从血清中纯化了抗体，这是人们开始有意识利用生物亲和作用纯化蛋白质的研究。由于亲和吸附介质制备技术的障碍，亲和分离技术的实用化进程进展缓慢。1967年Axen和Cuatrecasas等开发了利用溴化腈活化琼脂糖凝胶制备亲和吸附介质的方法，才使亲和分离技术从研究走向实用。20世纪80年代以后，亲和技术与其他分离技术如膜分离、萃取技术、电泳技术、色谱技术等相结合，相继出现了亲和色谱、膜亲和过滤、亲和萃取、亲和电泳等新型的亲和分离技术。其中最典型的是亲和色谱技术。第二节亲和分离原理一、生物亲和作用affinity（亲和）一词源于拉丁语的affinitus，原意为结婚或亲缘关系，因此在化学或生物化学中，affinity可以理解为分子之间的结合作用。实际上，亲和作用不止限于生物物质之间，对于简单的化合物，如Na+和Cl-通过静电作用相互吸引的现象也是一种亲和作用。因此，亲和作用是自然界普遍存在的现象，只是生物分子间的亲和作用具有更高的选择性。生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力。这种识别并结合的能力具有排他性，即生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合。生物亲和作用是生命诞生、维持与延续的重要基础，而亲和分离技术则是人类利用生物亲合作用的方式。亲和作用的本质：锁钥理论参与亲和作用的两个分子（或物质）中，其中之一为蛋白质的情况占绝大多数，或者两者均为蛋白质。蛋白质是高分子化合物，种类繁多、结构复杂，其参与亲和作用的机理尚不完全清楚，一般认为是蛋白质的立体结构中含有某些参与亲和结合的部位，这些结合部位呈凹陷或凸起状，能与该蛋白质发生亲和作用的分子恰好可以进入到此凹陷结构中，或者该蛋白质的凸起部位恰好能够进入与其发生亲和作用的分子的凹陷部位，就像钥匙和锁孔的关系一样。具有亲和作用的分子对之间具有钥匙和锁孔的关系是产生亲和作用的必要条件，但并不充分，除此之外，要想发生亲和作用还需要分子或原子水平的各种相互作用。（1）静电作用（2）氢键（3）疏水性相互作用（4）配位键（5）弱共价键静电作用：近距离产生较大的作用力，但应与其它因素结合才能具有亲和识别作用。氢键：分子中的氧原子和氮原子，可形成氢键作用。与原子间距离有关，应较近。疏水性相互作用：需两分子都具有疏水性基团。配位键：咪唑基（组氨酸）和Zn2＋、Cu2＋、Ni2＋等产生配位键，形成金属螯合结构。弱共价键：可逆共价键，结合力较弱。二、影响亲和作用的因素1、离子强度离子强度影响静电引力、氢键作用、疏水相互作用等。离子强度越大，静电力和氢键力都降低，而疏水作用增强。2、pH值在适当的pH下，亲和结合作用较高，在其它pH下，亲和作用减弱或完全破坏。如：当蛋白质的结合部位存在羧基时，在pH值等于该羧基的pKa时，该羧基的50%带负电荷，当pH值高于pKa一个pH单位时，该羧基的90%带负电荷，当pH值低于pKa一个pH单位时，该羧基的10%带负电荷。3、抑制氢键形成的物质脲和盐酸胍的存在可抑制氢键的形成，但容易使蛋白质变性。4、温度温度升高，静电力、氢键、金属配位键减弱，疏水力增强。5、离液离子SCN-，I-，ClO4-等离子半径较大的离液阴离子（破坏水化作用）存在时，疏水性亲和作用降低。6、螯合剂加入螯合剂（如EDTA），去除金属离子，破坏配位键，会使亲和作用消失。三、亲和作用体系将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联，可特异性结合另一种分子（目标产物），使其从混合物中高选择性地分离纯化。一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的配基（ligand），用L表示。Kd：解离常数Keq：结合常数Keq越大，亲和结合作用越强。Keq一般为104～108L/mol，最高（生物素－抗生物蛋白）可达到1015L/mol。亲和配基必须具备的条件(选择原则)：（1）专一性识别或特异性作用必须是可逆的配基与被分离生物大分子之间的专一性识别或特异性作用，必须是可逆的。（2）结合常数要适当配基与被分离分子之间结合力要有足够高，以能形成稳定的复合物；同时结合又不能太强，否则洗脱困难。（3）稳定性好，可进行化学改性（4）固定到载体上后配基的专一性识别或特异性作用不发生明显的变化。专一性和特异性决定着分离纯化的产品纯度，相互作用的强弱决定着吸附和解吸的难易程度。配基的类型：单专一性的小分子配基基团专一性的小分子亲和配基专一性的大分子亲和配基免疫亲和配基基团专一性的大分子亲和配基（1）酶的抑制剂小分子抑制剂有苄脒（benzamidine）、精氨酸和赖氨酸等。（2）抗体利用抗原与抗体间特异性结合的亲和技术称为免疫亲和技术。抗体与抗原之间的Keq一般为107～1012L/mol。因此，利用免疫亲和法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。（3）A蛋白ProteinA为分子量约42kD的蛋白质，与IgG具有很强的亲和作用，结合部位为IgG分子的Fc片段。A蛋白分子上含有5个Fc片段可结合部位。不同IgG的Fc片段的结构非常相似，因此A蛋白可作为各种抗体的亲和配基，但不同抗体的结合常数有所不同。A蛋白与抗体结合并不影响抗体与抗原的结合能力，因此A蛋白也可用于分离抗原-抗体的免疫复合体。（4）凝集素凝集素（lectin）是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称。伴刀豆球蛋白A（concanavalinA，conA）可用做糖蛋白、多糖、糖脂等含糖生物大分子的分析、纯化。pH＜5.6时conA为二聚体，分子量为52kD；pH＞5.6时为四聚体，分子量为102kD，两个亚基（subunit）之间通过二硫键结合。因此，在利用conA为配基的亲和分离技术中，操作条件应当适宜。（5）辅酶和磷酸腺苷脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用。辅酶主要有NAD（nicotinamideadeninedinucleotide）、NADP（NADphosphate）和ATP（adenosinetriphosphate）等。这些辅酶可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。AMP（adenosine5'-monophosphate）、ADP（adenosine2'，5'-diphosphate）的腺苷部分与上述辅酶的结构类似，可用做这些酶的亲和配基。（6）三嗪类色素Triazinedyes是一类分子内含有三嗪环的合成染料，与NAD的结合部位相同，又称为生体模拟色素（biomimeticdye）。除脱氢酶和激酶外，三嗪类色素还与血清白蛋白、干扰素、核酸酶和糖解酶等具有很高的亲和力。CibacronBlueF3GA：（7）过渡金属离子Cu2+，Ni2+，Zn2+和Co2+等过渡金属离子可通过与亚胺二乙酸（IDA）或三羧甲基乙二胺（TED）形成螯合金属盐固定在固定相粒子表面，用做亲和吸附蛋白质的配基。（8）组氨酸组氨酸可与蛋白质发生亲和结合作用：静电和疏水性相互作用均有可能参与亲和结合。在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质pI的溶液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着盐浓度增大，亲和吸附作用降低。（9）肝素肝素（heparin）是存在于哺乳动物的肝、肺、肠等脏器中的酸性多糖类物质，分子量一般为5至30kD，具有抗凝血作用。肝素与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等具有亲和作用，可用作这些物质的亲和配基。肝素的亲和结合作用在中性pH和低浓度盐溶液中较强，随着盐浓度的增大结合作用降低。亲和配基的选择（1）组合化学肽库选择亲和配基目标肽→反义肽→组合合成→亲和筛选→优选序列（2）噬菌体展示技术目标蛋白→可结合噬菌体→扩增→多轮筛选单克隆群体→氨基酸序列（3）SELEX技术随机序列→PCR扩增→特异性结合→重复筛选间隔臂当配基的分子量较小的时候，如果将其直接固定到载体上，会由于空间位阻的影响，配基与生物大分子不能发生有效的结合。这时需要在配基和载体之间引入一个间臂分子，使配基和生物大分子发生有效作用。引入间臂分子最常用的方法:先将间臂分子氨烷基化合物NH2(CH2)nCOOH、NH2(CH2)nNH2连接到载体上。然后将亲和配基连接在间臂分子上。羧基和氨基在碳二亚胺的作用下可以缩合形成酰胺键。间臂的长度是很重要的因素，太短，效果不明显；太长，间隔臂容易弯曲，结合效果会下降。实验结果表明，一般引入4－6个亚甲基时，间臂分子效果较好，常用的间臂分子为ω-氨基己酸、1，6-二氨基己烷。载体要求：（1）具有亲水、多孔结构；（2）含有可活化的反应基团；（3）理化性质稳定，不因共价偶联反应的条件及吸附条件的变化而发生变化；（4）非特异吸附小。多糖类的凝胶过滤介质表面含有大量可活化的羟基可作为亲和配基的载体。表面具有氨基的聚丙烯酰胺类的载体也常作为亲和配基的载体。还可采用一些无机载体如硅胶和多孔玻璃。常用载体纤维素(cellulose)琼脂糖凝胶葡聚糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶多孔玻璃珠（Bio-Glass）其它载体——壳聚糖(Chitosan)（1）纤维素纤维素结构紧密、均一性差，不利于大分子的渗入。非特异性吸附力较强，空间位阻。主要用于分离与核酸有关的物质。（2）琼脂糖凝胶琼脂糖浓度有2%、4%、6%，商品为Sepharose2B、4B和6B（Pharmacia）。保持吸附物质活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构疏松孔径大，流速快。稳定性好，能在pH3~14中应用。（3）葡聚糖凝胶：葡聚糖凝胶孔径太小，偶联配基后，孔径更小，应用受到限制。（4）聚丙烯酰胺凝胶：Bio-gelP有供化学反应的酰胺基，能制得配基含量较高的亲和柱，适用于亲和势比较低的系统。pH过高或过低的溶液中酰胺基易水解。（5）多孔玻璃珠：化学与物理稳定性较好，机械强度高。缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质有非特异性吸附，化学活性基团少。（6）其它载体——壳聚糖第三节亲和分离技术的应用一、亲和分离过程1、配基固定化：配基与载体偶联，结合成具有特异亲和性的分离介质。2、吸附样品：亲和层析介质选择性吸附生物活性物质。3、样品解吸：选择适宜的条件使被吸附物活性物质解吸。目标产物的洗脱方法有特异性洗脱和非特异性洗脱。（1）特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，洗脱目标产物。例如：Lys和Arg均为t-PA（组织纤溶酶原激活剂，一种糖蛋白）的抑制剂，利用固定化Lys为配基亲和分离t-PA时，可用Arg溶液进行洗脱。利用conA为配基的目标产物可用葡萄糖溶液洗脱。特异性洗脱法的洗脱条件温和，有利于保护目标产物的生物活性，另外，由于仅特异性洗脱目标产物，对于特异性较低的亲和体系（例如，用三嗪类色素为配基时）或非特异性吸附较严重的物系，特异性洗脱法有利于提高目标产物的纯度。（2）非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离子强度、离子种类或温度等降低目标产物的亲和吸附作用。二、亲和分离技术1、亲和色谱利用偶联有亲和配基的层析介质为固定相，根据生物分子之间的亲和作用进行物质分离的色谱方法。与固定床吸附操作类似，其过程包括：进料（feedstockloading）杂质清洗（contaminantwashing）目标产物洗脱（targetproductelution）色谱柱再生（columnregeneration）对大多数亲和层析，一步可以达到很高的纯化倍数。特异性高的亲和层析洗脱只出一个峰，对亲和作用选择性较低的分离，可用梯度