第一篇第4章微生物的生理

第四章微生物的生理第一节微生物的酶第二节微生物的营养第三节微生物的产能代谢概述：酶的研究历史酶的发现和提出：1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母汁成功实现了发酵。提出了发酵与活细胞无关，而与细胞液中的酶有关。1913年，Michaelis和Menten提出了酶促动力学原理—米氏学说。1926年，Sumner从刀豆种子中分离、纯化得到了脲酶结晶，首次证明酶是具有催化活性的蛋白质。1928年，Cech对四膜虫的研究中发现RNA具有催化作用。第一节微生物的酶酶是活细胞产生的一类具有催化功能的蛋白质，亦称为生物催化剂Biocatalysts。绝大多数的酶都是蛋白质(Enzyme和Ribozyme)。酶催化的生物化学反应，称为酶促反应Enzymaticreaction。在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物substrate。一、酶（Enzyme）的概念二、酶的组成辅酶或辅基C、H、O、N、S、P、Cu、Fe、I、Zn、Mo单成分酶=酶蛋白双成份酶全酶=酶蛋白+全酶=酶蛋白+全酶=酶蛋白+铁卟啉、辅酶A、NAD（辅酶I）、FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）有机物有机物+金属离子金属离子三、酶的分类单成分酶、全酶（双成份酶）；胞内酶，胞外酶，表面酶；结构酶，诱导酶；水解酶、氧化还原酶、转移酶、异构酶、裂解酶、合成酶。酶分子的基本结构单位——氨基酸自然界中氨基酸种类100种组成蛋白质的氨基酸：20种（基本氨基酸／蛋白质氨基酸）除脯氨酸外，其余都是－氨基酸四、酶蛋白的化学结构氨基酸的种类Gly,G,甘氨酸Ala,A,丙氨酸Val,V,缬氨酸Leu,L,亮氨酸Ile,I,异亮氨酸Met,M,甲硫氨酸Phe,F,苯丙氨酸Tyr,Y,络氨酸Trp,W,色氨酸氨基酸的种类Ser,S,丝氨酸Thr,T,苏氨酸Cys,C,半胱氨酸Pro,P,脯氨酸Asn,N,天冬酰胺Gln,Q,谷氨酰胺氨基酸的种类Lys,K,赖氨酸Arg,R,精氨酸His,H,组氨酸氨基酸的种类Asp,D,天冬氨酸Glu,E,谷氨酸氨基酸的种类肽和肽键Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu;SGYAL蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构就是蛋白质分子中氨基酸的排列顺序。蛋白质的一级结构就是蛋白质分子中氨基酸的排列顺序。蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构是指多肽链借助氢键沿一维方向排列呈具有周期性的结构的构象，它是多肽链骨架的排列规则，而不涉及侧链的类型与构象。类型主要包括：－螺旋β－折叠β－转角－螺旋－螺旋是蛋白质中含量最多，也是最稳定的二级结构单元。－螺旋丰富的蛋白质结构紧密而稳定少变，故蛋白质的功能活性区常不在－螺旋区，而在其附近。β－折叠β－折叠在蛋白质中含量仅次于－螺旋，和－螺旋相比，稳定性相对较差，结构参数较易变化，扭曲程度也可各有不同，一般位于蛋白质的中心，外面由稳定的－螺旋包围。也有蛋白全由β－折叠组成，如免疫球蛋白，这样的结构相对较柔软，易于发生构象变化。平行式β－折叠β－转角β－转角一种二级重要的结构，在其它二级结构之间起连接作用。它可以出现在－螺旋之间、－螺旋与β－折叠之间、或反平行的β－折叠之间连接两段肽链。在球蛋白中含量颇多，并常位于分子表面。蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构是蛋白质分子内所有原子在三维空间的立体排布。是二级结构和非二级结构在空间中的进一步盘曲、折叠，形成包括主侧链在内的专一性三维排布。其基本特征是：每个残基的构象符合热力学要求.肌红蛋白的三级结构4.蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构是指亚基和亚基之间通过疏水相互作用，结合成为有序排列的特定空间结构。构成寡聚蛋白质分子的亚基可以相同，也可以不同。一级结构(primarystructure)二级结构(secondarystructure)三级结构(tertiarystructure)四级结构(quarternarystructure)五、酶蛋白的活性中心（一）基本概念：酶的活性中心是指结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。酶的活性中心包括两个功能部位：结合部位和催化部位。1．结合部位（Bindingsite）酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。此部位决定酶的专一性。2．催化部位（catalyticsite）酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位。此部位决定酶所催化反应的性质。（必需基团、非必需基团）必需基团:酶分子中有些基团若经化学修饰（氧化、还原、酰化、烷化）使其改变，则酶的活性丧失，这些基团称为必需基团。非必需基团：有的酶温和水解掉几个AA残基，仍能表现活性，这些基团即非必需基团。酶活性中心的结构特点活性中心只占酶分子总体积的很小一部分，往往只占整个酶分子体积的1%-2%。某些酶活性部位的AA残基酶AA残基数活性部位的AA残基核糖核酸酶124His12,His119,Lys41溶菌酶129Asp52,Glu35胰凝乳蛋白酶241His57,Asp102,Ser195胃蛋白酶348Asp32,Asp215木瓜蛋白酶212Cys25,His159羧肽酶A307Arg127,Glu270,Tyr248,Zn2+牛胰蛋白酶六、蛋白质生物结构与功能的关系1.一级结构决定空间结构相似结构相似功能不同结构不同功能一级结构改变可导致功能的丧失、分子病的产生2.蛋白质生物功能的表达依赖于其完整的构象一、蛋白质在某些理化因素的作用下，其空间结构受到破坏，从而改变其理化性质，并失去其生物活性，称为蛋白质的变性。二、变性的实质是破坏了蛋白质的空间结构，并不引起一级结构的改变。蛋白质的变性蛋白质两性电离阳离子pHpI阴离子pHpI兼性离子pH=pI蛋白质的沉淀++++→←--------疏水胶体沉淀疏水胶体七、酶的作用特点（一）酶和一般催化剂的共性用量少而催化效率高；它能够改变化学反应的速度，但是不能改变化学反应平衡。酶本身在反应前后也不发生变化。酶能够稳定底物形成的过渡状态，降低反应的活化能，从而加速反应的进行。（二）酶作为生物催化剂的特性酶的催化作用可使反应速度提高10７–101３倍。例如：过氧化氢分解2H2O22H2O+O2用Fe3+催化，效率为6X10-4mol/mol.S，而用过氧化氢酶催化，效率为6X106mol/mol.S。转换数（turnovernumber）的概念：每秒钟每个酶分子能催化底物发生变化的微摩尔数，用kcat表示（mol/S）。-淀粉酶催化淀粉水解，1克结晶酶在65C条件下可催化2吨淀粉水解。1．高效性（酶具有极高的催化效率）酶的专一性Specificity又称为特异性，是指酶在催化生化反应时对底物的选择性，即一种酶只能作用于某一类或某一种特定的物质。亦即酶只能催化某一类或某一种化学反应。例如：蛋白酶催化蛋白质的水解；淀粉酶催化淀粉的水解；核酸酶催化核酸的水解。2．专一性Specificity有些酶的作用对象不是一种底物，而是一类化合物或一类化学键。这种专一性称为相对专一性(RelativeSpecificity)。包括：族(group)专一性（对键两端的基团要求的程度不同，只对其中一个基团要求严格）。如-葡萄糖苷酶，催化由-葡萄糖所构成的糖苷水解，但对于糖苷的另一端没有严格要求。胰蛋白酶，水解硷性氨基酸的羧基形成的肽键。键(Bond)专一性。如酯酶催化酯的水解，对于酯两端的基团没有严格的要求。（1）相对专一性(RelativeSpecificity)（2）绝对专一性（Absolutespecificity)有些酶对底物的要求非常严格，只作用于一个特定的底物。这种专一性称为绝对专一性（Absolutespecificity)。例如：脲酶、麦芽糖酶、淀粉酶、碳酸酐酶及延胡索酸水化酶（只作用于反丁烯二酸）等。酶的一个重要特性是能专一性地与手性底物结合并催化这类底物发生反应。即当底物具有旋光异构体时，酶只能作用于其中的一种。例如，淀粉酶只能选择性地水解D－葡萄糖形成的1，4－糖苷键；L-氨基酸氧化酶只能催化L-氨基酸氧化；乳酸脱氢酶只对L-乳酸是专一的。旋光异构专一性（3）立体异构专一性StereochemicalSpecificity，stereospecificity酶促反应一般在pH5-8水溶液中进行，反应温度范围为20-40C。高温或其它苛刻的物理或化学条件，将引起酶的失活。3．反应条件温和４．酶易失活凡能使蛋白质变性的因素如强酸、强碱高温等条件都能使酶破坏而完全失去活性。所以酶作用一般都要求比较温和的条件如常温、常压和接近中性的酸硷度。５.酶活力可调节控制如抑制剂调节、共价修饰调节、反馈调节、酶原激活及激素控制等。６.某些酶催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关酶作为生物催化剂的特性1．高效性2．专一性3．反应条件温和4．酶易失活5.酶活力可调节控制6.某些酶催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关。锁钥学说（1894年EmilFischer）—lockandkey或模板学说（temolate）：认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。（酶的多底物现象、酶对正反方向的催化、相对专一性）诱导契合学说（1958年D.Koshland)_inducedfit：该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状,从而有利于底物的结合。酶作用专一性的机制诱导契合学说的要点酶有其原来的形状，不一定一开始就是底物的模板底物能诱导酶蛋白的形状发生一定变化（专一性结合）当酶的形状发生变化后，就使得其中的催化基团形成正确的排列。在酶反应过程中，酶活性中心构象的变化是可逆的。即酶与底物结合时，产生一种诱导构象，反应结束时，产物从酶表面脱落，酶又恢复其原来的构象。降低反应的活化能（activationenergy）活化能:在一定温度下一摩尔底物全部进入活化态所需要的自由能，单位是KJ/mol.（增加温度、加入催化剂降低反应活化能）酶促反应：E+S===ES===ES*EPE+P非酶促反应：SP催化剂的作用是降低反应活化能,从而起到提高反应速度的作用。酶作用高效率的机制反应过程中能的变化实例：H2O2的分解无催化剂时活化能为75.24KJ/mol;铂为催化剂时48.9;H2O2酶为催化剂8.36反应进程H2O2酶无催化剂自由能能底物产物ESES*EP铂催化剂八、影响酶活力的因素1.酶浓度对酶促反应速度的影响2.底物浓度对酶促反应速度的影响3.温度对酶促反应速度的影响4.pH对酶促反应速度的影响5.激活剂对酶促反应速度的影响6.抑制剂对酶促反应速度的影响1、酶浓度对酶促反应速度的影响在酶促反应体系中，当底物浓度大大超过酶的浓度，使酶被底物饱和时，反应速度与酶的浓度变化成正比关系。V=K3[E]。V[E]在低底物浓度时,反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。当底物浓度达到一定值，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。02468101214161820020406080100ConcentrationofSubstrate(umol/L)RateofReaction(v)1903年，Henri用蔗糖酶水解蔗糖的实验2、底物浓度对酶促反应速度的影响酶与底物的中间络合物学说（Henri和Wurtz）E+SESE+P1913年前后，Michaelis和Menten在前人工作的基础上，假定E+SES快速建立平衡，底物浓度远远大于酶浓度，ES分解产物的逆反应忽略不计，推导出下列方程：V=Vmax[S]Km+[S]米氏方程•米氏方程V=Vmax[S]Km+[S]Km即为米氏常数，Vmax为最大反应速度当反应速度等于最大速度一半时,即V=1/2Vmax,Km=[S]上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。因此,米氏常数的单位为mol/L。1913年前后，Michaelis和Menten提出“米氏学说”当[S]Km时，v=Vmax/Km[S]当