分子生物技术在污水处理系统内硝化菌群研究中的应用

应用与环境生物学报2010，16(1):135~142ChinJApplEnvironBiol=ISSN1006-687X2010-02-25DOI:10.3724/SP.J.1145.2010.00135污水生物处理系统内的微生物学研究是污水生物处理中最基本、最重要的内容，是污水生物处理系统高效稳定运行的保障.传统的微生物学研究方法过于依赖纯培养技术来进行菌种分离，该方法对于研究污水生物处理系统内的微生物有着严重的缺陷.首先，污水生物处理系统内的微生物菌群是由多种微生物构成、具有一定空间分布的聚集体.这些微生物相互依存、相互竞争，具有复杂的种群关系.当进行菌种分离培养后，将无法获取自然条件下微生物菌群结构与空间分布的信息.其次，由于微生物的基因表达和代谢活动受外界环境因素的影响较大，菌种的分离培养将会改变微生物的生理特性和生化特性，从而降低对实际工程实践的指导意义.此外，纯培养需要较长的时间，而且有些菌种（如亚硝酸盐氧化菌中的Nitrospira.）目前还无法通过纯培养技术实现纯种分离.近年来，分子生物技术的快速发展为污水生物处理系统内微生物研究提供了新的分析方法和手段.污水生物脱氮包括硝化和反硝化两大阶段.其中硝化菌群是硝化阶段的功能微生物，包括将NH4+-N氧化为NO2--N的氨氧化菌（Ammoniaoxidizingbacteria，AOB）和将NO2--N氧化为NO3--N的亚硝酸盐氧化菌（Nitriteoxidizingbacteria，NOB）.AOBAOB和NOB在污水生物处理系统内的生物活性和菌群分布的稳定性，是保证污水生物脱氮系统稳定运行的关键因素之一.分子生物技术在污水处理系统内硝化菌群研究中的应用*李磊曾薇**张悦杨莹莹（北京工业大学环境与能源工程学院北京100124）ApplicationofMolecularBiologicalTechniquesforAnalyzingNitrifierCommunitiesinWastewaterTreatment*LILei,ZENGWei**,ZHANGYue&YANGYingying(CollegeofEnvironmentalandEnergyEngineering,BeijingUniversityofTechnology,Beijing100124,China)Abstract�o�ecu�arbio�ogica�techni�ue��ha�e�ro�idedacu�ti�ation-inde�endentmean���ortheidenti�icationo��o�ecu�arbio�ogica�techni�ue��ha�e�ro�idedacu�ti�ation-inde�endentmean���ortheidenti�icationo�environmentalmicroorganisms.Themolecularbiologicaltechniquesbasedonfluorescentinsituhybridization(FISH)and�o�ymera��echainreaction(PCR)wereintroduced,inc�udingFISH-�AR,FISH-microe�ectrode��,C�one-FISH,SIP,PCR-DGGE-c�oning-��e�uencing,PCR-T-RFLP,rea�-time��uore��cent�uantitati�ePCRandRT-PCR.Themechani��m��andapplicationsofthesetechniquesintheinvestigationofnitrifiercommunitiesinwastewatertreatmentsystemswerestudied.Byusingthesetechniques,thenitrifiercommunitiescouldbeidentifiedinthesystems,andthecorrelationbetweenthedynamicvariationinthenitrifiercommunitiesandtheoperatingparametersofthesystemscouldbeestablished,andtherealstateofthe��y��temo�erationcou�da���obeana�yzedand�ro�eddirect�yandre�iab�y.There��u�t���romthi����tudy�ro�idetheoretica���u��ort���orthe�ong-range��tab�eo�erationo�thewa��tewatertreatment��y��tem��,andthi���a�er�ut���orward��ome��ugge��tion��forthefutureapplicationofthosetechniquesinthisfield.Fig5,Tab1,Ref53Keywordsnitrifiercommunity;molecularbiologicaltechnique;fluorescentinsituhybridization(FISH);polymerasechainreaction(PCR);stableisotopeprobing(SIP);biologicalwastewatertreatmentCLCX703.1:X172摘要不依赖于纯培养的分子生物技术已广泛应用于环境微生物的研究.综述了近年来在荧光原位杂交技术（F�uore��centin��ituhybridization，FISH）和聚合酶链式反应技术（Po�ymera��echainreaction，PCR）基础上发展起来的几种新分子生物技术的基本原理，包括FISH-�AR、FISH-microe�ectrode��、C�one-FISHISH、SIP、PCR-DGGE-c�oning-c�oning-��e�uencing、PCR-T-RFLP、Real�timefluorescentquantitativePCReal�timefluorescentquantitativePCR和RT-PCR，以及其在污水生物处理系统内硝化菌群研究领域中的应用现状.通过这些分子生物技术，可以识别污水生物处理系统内的硝化菌群；建立硝化菌群动态变化与工艺运行参数之间的相关关系；从微生物学角度对系统运行状态给予最直接、最可靠的分析与证明，为污水生物处理系统的长期稳定运行奠定理论基础.最后对该领域的未来发展进行了展望.图5表1参53关键词硝化菌群；分子生物技术；荧光原位杂交；聚合酶链式反应；稳定同位素探测；污水生物处理CLCX703.1:X172收稿日期：2009-03-27接受日期：2009-04-27*国家自然科学基金项目（No.50878005）、北京市自然科学基金项目（No.8102005）和北京市优秀人才培养资助计划（No.20081D0501500178）资助Su��ortedbytheNationa�Natura�ScienceFoundationo�China(No.50878005),theNatura�ScienceFoundationo�Beijing,China(No.8102005),andtheExce��entRe��earcherSu��ortingProgramo�Beijing,China(No.20081D0501500178)**通讯作者Corre���ondingauthor(E-mai�:[e-mail])13616卷应用与环境生物学报ChinJApplEnvironBiol因此，采用分子生物技术对不同工艺、水质条件下的AOB和NOB的菌群结构、活性等进行研究分析，能够为污水生物脱氮系统的长期稳定运行提供有力保障.目前，以FISH和PCR为代表的分子生物技术已广泛应用于污水生物处理系统内硝化菌群结构和生物活性的研究中，国外已有大量的相关文献报道，但在国内还处于起步研究阶段.1基于FISH技术的分析方法FISH技术是根据目标微生物16SrRNA基因中的特异性序列，设计相应的、带有荧光染料的寡核苷酸探针，按照碱基序列互补原则，将探针直接原位杂交到目的基因上，杂交成功的探针就会产生荧光信号.然后通过共聚焦激光扫描显微镜（Con�oca��a��er��canningmicro��co�yon�oca��a��er��canningmicro��co�y，CLS�）或者荧光显微镜对目的基因进行定性和相对定量分析.典型的FISH图片如图1所示.通过选取系统发育中保守性不同的特异性序列，就可在种、属水平上对微生物进行检测.因此，FISH技术还可用于研究微生物种群的结构动态变化.自从Amann等最初将FISH应用于环境微生物的原位分析[1]以来，该方法已被用于污水生物处理系统内丝状菌[3]、聚磷菌[3]、硝化菌[4~5]、厌氧氨氧化菌[6]等的原位检测.近几年，研究者在普通FISH的基础上发展了几种更为先进的分子生物学分析方法，用于对污水生物处理系统内硝化菌群的研究：FISH-�AR（�icroautoradiogra�hy，显微放射自显影）技术、FISH-microe�ectrode��（�icroe�ectrode��，微电极）技术和C�one-FISH�one-FISH技术.1.1FISH-�AR单独采用FISH技术，并不能获取微生物种群的生物代谢活性和生理功能的信息.而单独采用�AR技术，却无法对微生物种群的组成及其分布加以识别.Lee等首先将这两种技术结合，建立了FISH-�AR方法[7].该方法能够以显微照片的形式，清晰、直观地显示出复杂的微生物群体的菌群结构及其原位空间分布情况，而且同时能够反映出不同微生物种群的生物代谢活性.该方法的基本流程[7]可总结如图2，其核心思想是将待分析的微生物样本放置在经放射性物质标记的有机或无机底物中进行培养，其中能够吸收放射性底物的细胞将在放射自显影的显微图片上呈现黑色的影像（�AR阳性，�AR+），而没有吸收放射性底物的细胞则没有影像显示.对于异养型微生物通常采用14C标记的有机底物，如14C-乙酸；对于无机自养型硝化细菌，通常采用NaH14CO3.图3为一典型的Fi��h-�AR显微图片[8]，图中的黑色细胞为吸收了NaH14CO3的化能自养型细菌，红色细胞为通过FISH探针检测到的AOB，二者的细胞数比例表示化能自养型细菌中AOB所占的比例；绿色细胞是FISH探针检测到的NOB.Okabe课题组采用FISH-�AR方法对自养型硝化生物膜中的微生物代谢进行了研究.研究者首先将自养型硝化生物膜在含有NaH14CO3的底物中培养6h，其中自养硝化菌呈�AR+，异养菌呈�AR-.再将含�AR+硝化菌和�AR-异养菌的生物膜在仅含有NH4+的溶液中培养10d，结果发现多数异养菌呈现�AR+，说明异养菌能够利用14C标记的硝化菌细胞裂解产物或代谢产物，从而揭示了在碳源受限的自养型硝化生物膜中微生物在底物利用上的相互作用关系[8~9].该研究指出在碳源受限的硝化生物膜中硝化菌与异养菌各占50%，其中α-Proteobacteria23%、γ-Proteobacteria13%、绿色非硫细菌9%、Cyto�hagaF�a�obacteriumBacteroide��2%、不能确定的微生物3%.Gie��eke等也采用FISH-�AR方法对生物膜中的硝化图1SBR生物膜反应器内不同时期的AOB（绿色）、NOB（红色）以及厌氧氨氧化菌（蓝色）的FISH分析图片[6]Fig.1FISHana�y��i��o�ammonia-(�abe�edingreen),nitrite-(inred)andanaerobicammonia-oxidizer��(inb�ue)inaseque