芬顿法深度处理生物处理排水中的四环素抗性基因

中国环境科学2017,37(9)：3315~3323ChinaEnvironmentalScience芬顿法深度处理生物处理排水中的四环素抗性基因曾萍1,刘诗月2,张俊珂3,宋永会1*,刘瑞霞1,刘洋4(1.中国环境科学研究院,城市水环境科技创新基地,北京100012；2.中国地质大学(北京)水资源与环境学院,北京100083；3.中国矿业大学(北京)化学与环境工程学院,北京100083；4.阿尔伯特大学土木与环境工程系,加拿大7-263)摘要：以四环素抗性基因tet(L)、tet(E)为研究对象,考察了芬顿氧化技术对四环素抗性基因废水深度处理的效果.采用定量PCR与DGGE技术检测了芬顿法处理前后生物处理排水中的四环素抗性基因的丰度与废水中菌群丰度的变化.结果显示,在最佳反应条件:反应时间10min,pH值为5,[H2O2]/[Fe2+](物质量的比)=8且H2O2的浓度达到0.2mol/L时,16SrRNA及四环素抗性基因(tetgenes)的去除效果最好.同时分析芬顿氧化前后的DGGE图谱可知,细菌菌群间的丰度有了明显的变化.相关性分析可知,各目标基因与单因素间、各目标基因之间,各样品中目标基因含量的变化与DGGE条带变化之间都没有明显相关性.结果表明,芬顿试剂可能不仅仅是通过削减单位水体中抗性菌的浓度来降低抗性基因浓度,还通过其他的方式来去除单位水体中的抗性基因的浓度,这还有待进一步研究证明.关键词：四环素抗性基因；芬顿氧化；定量PCR；凝胶电泳；相关性分析中图分类号：X703.1文献标识码：A文章编号：1000-6923(2017)09-3315-09advancedFentonoxidationtreatmentoftetracyclineresistancegenesineffluentdischargedfrombiologicalwastewatertreatment.ZENGPing1,LIUShi-yue2,ZHANGJun-ke3,SONGYong-hui1*,LIURui-xia1,LIUYang4(1.DepartmentofUrbanWaterEnvironmentalResearch,ChineseResearchAcademyofEnvironmentalSciences,Beijing100012,China；2.SchoolofWaterResourcesandEnvironment,ChinaUniversityofGeosciences,Beijing100083,China；3.SchoolofChemical&EnvironmentalEngineering,ChinaUniversityofMiningandTechnology(Beijing),Beijing100083,China；4.DepartmentofCivilandEnvironmentalEngineering,UniversityofAlberta,Edmonton,Alberta,7-263,Canada,China).ChinaEnvironmentalScience,2017,37(9)：3315~3323Abstract：Fentonoxidationwasusedtoremovetetracyclineresistancegenes(tetgenes:tetLandtetE)fromwastewater.Changesintherelativeabundanceoftetgenesandthebacterialcommunitystructureweremonitoredusingquantitypolymerasechainreaction(q-PCR)anddenaturinggradientgelelectrophoresis(DGGE).Thehighestremovalefficienciesfortetracyclineresistancegenesand16SrRNAwereachievedattheoptimalconditions,includingthereactiontimeof10min,pHof5,H2O2/Fe2+molarratioof8andH2O2concentrationof0.2mol/L.DGGEanalysisshowedremarkablechangesinthebacterialcommunitydiversitiesafterFentonoxidation.However,nosignificantcorrelationwasobservedeitherbetweentheremovaloftetgenesandtheparametersusedinFentonoxidation,orbetweentheremovaloftetgenesandthechangeinthebacterialcommunitystructures.Theseresultsmaysuggestedthattheremovaloftetgenesmaynotonlyattributetotheremovaloftetracyclineresistancebacteria.Futureinvestigationsmaybenecessarytofurtherunderstandtheremovalmechanismsindetails.Keywords：tetracyclineresistancegenes；Fentonoxidation；quantityPCR；DGGE；correlationanalysis近年来,由于抗生素滥用而导致的大量耐药性致病菌和抗性基因(antibioticresistancegenes,ARG)的出现已对环境产生了相当的影响.自Pruden[1]在2006年首次将抗生素抗性基因作为环境中的新型污染物提出,国际上对ARG在环境研究领域受关注的程度日益增加.作为目前使用最广泛、用量最大的抗生素种类之一的四环素类抗生素,由其导致的ARB和ARG所产生的环境影响尤其受到人们的重视.目前,人们已在许多收稿日期：2017-02-10基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务专项(2016YSKY-027);国家环境保护环境微生物利用与安全控制重点实验室开放基金资助(MARC2012D008)*责任作者,研究员,[e-mail]3316中国环境科学37卷环境中分离得到多种ARB与ARG[2-3].如Pruden等[1]、Pei等[4]在美国北科罗拉多河和CacheLaPoudre河水及底泥中均检测出四环素抗性菌(tetARB)与四环素抗性基因(tetgenes).在我国,太湖和长江南京段检测到了整合子intI1、2种tetgenes(tet(A)和tet(C))[5],北京温榆河流域耐药大肠杆菌对四环素的耐药率为5%~25%[6],珠江水域、海河流域、黄浦江、北江河等自然水体中也检测出了tetgenes[5,7-9].而作为ARG聚集地的医院、养殖场和污水处理厂,其ARG的丰度更高,对人类健康的威胁也更加严重[10-17].刘苗苗等[18]研究发现,制药废水与城市污水排放口水样中的总ARB比例比排放口上游增加了10~1000倍.吴楠等[19]对北京市的一家养猪厂进行了研究,检测到了5种抗性基因(tet(B/P)、tet(M)、tet(O)、tet(T)、tet(W)),并在一定程度上说明了ARG横向转移机制的存在.代敏等[20]对猪源沙门氏菌的四环素抗药性进行了检测,发现其耐药率达到100%,而tet(C)的检出率也达到75%.已有的研究表明,污水处理厂中ARG的分布与ARG种类及抗生素浓度有关,ARG的去除效果与工艺也有很大关系,甚至受处理系统参数的影响.Kim等[21]认为活性污泥本身对ARB与ARG去除的效果不明显[21].Munir等[22]认为膜生物反应器(membranebio-reactor,MBR)工艺比传统活性污泥工艺具有显著的ARB与ARG的去除效果.Xia等[23]的研究结果表明,降低污泥停留时间(sludgeretentiontime,SRT)可促使缺氧/好氧-MBR系统内细菌总数明显下降,但ARG比例增加,而固定化缺氧/好氧-MBR系统内细菌总数与ARG量受水力停留时间(hydraulicretentiontime,HRT)影响较小.甚至还有一些研究表明[16,24-25],在污水处理过程中细菌通过自身基因突变和可动的遗传因子的水平转移获得耐药性,并在处理设施中逐渐积累耐药性,使得ARG的丰度增加了.所以,目前污水处理工艺对ARB和ARG的去除效果还没有一致的定论.在传统的污水处理工艺的基础上,一些研究者对tetgenes进行了深度处理,但研究结果不足以支持统一的结论.如采用垂直流人工湿地对猪场养殖废水中抗性基因有明显的处理效果[26];污泥的深度脱水后抗性基因的去除率均达到80%以上[27];混凝剂对污水中tet(G)和tet(X)都有比较明显的去除效果[28];采用次氯酸钠消毒可以显著降低出水中的抗性基因[3].而有的研究者发现次氯酸钠和UV消毒工艺对去除出水中的抗性基因没有显著作用[22,29];加碱处理对污泥中的抗性基因没有去除效果[30].目前已有研究采用各种方法来处理tetgenes,但处理效果众说纷纭,没有得出一致的结论.作为高级氧化技术的芬顿法,一方面可以通过H2O2和Fe2+相互作用产生羟基自由基,氧化处理难降解废水或一般氧化剂处理效果不明显的废水,另一方面又可以形成氢氧化铁聚合物产生良好的絮凝效果.在氧化过程结束后,形成的胶体在絮凝沉降的同时会吸附水样中存在的微生物碎片以及胞外存在的ARG,很好的将ARG从水相中去除.但是现阶段,对芬顿法处理tetgenes的研究还不充分.Cengiz等[31]虽然较早的使用了芬顿试剂来处理畜牧场废水中的tet(M),但研究仅限于对处理后凝胶中tet(M)条带亮度的变化的分析,而缺乏对ARG去除的定量分析.本文选取了tet(L)、tet(E)为目标物,使用实时荧光定量PCR技术为研究手段,初步研究了芬顿法对tetgenes的处理效果,同时用变性梯度凝胶电泳(DGGE)表征了时间、pH及H2O2、FeSO4投加量的不同对四环素抗性基因废水中群落的影响以及各单因素与16SrRNA、tet(L)、tet(E)、群落变化的相关性.1材料与方法1.1试剂和仪器本研究所用样品采自实验室SBR反应器.反应器流程如图所示.反应器每4h进行1次排水和进水.样品在每次采样当天06:00到10:00循环的排水期前半个小时内采集.反应器出水使用灭菌玻璃瓶采集,采集后保存在4℃冰箱里待用.水样初始水质条件和初始基因定量结果如表1所示.9期曾萍等：芬顿法深度处理生物处理排水中的四环素抗性基因3317进水泵出水泵曝气进水桶出水SBR反应器图1SBR反应器结构及运行流程Fig.1StructureandprocesschartofSBR表1初始原水水质和目的基因含量Table1qualitiesandtargetgenesofrawwater四环素浓度(mg/L)16SrRNA(log(copies/mL))tet(L)(log(copies/mL))tet(E)(log(copies/mL))未检测到7.681.022.251.2芬顿试验方法芬顿试验选择时间、pH值、H2O2用量、FeSO4.7H2O用量为变量,考察不同条件下抗性基因的变化.室温下,取400ml样品于1L灭菌烧杯中,用98%的浓硫酸调节pH值为设定初始值,加入一定量的H2O2(30%)和FeSO4.7H2O,在磁力搅拌下反应一定时间,然后用5mol/LNaOH调节pH为11,静置2h后,上清液pH值降至8.2~8.5.然后取上清液定容到250ml,过0.22um玻璃纤维滤膜(millipore,USA),从