高抗铜青霉菌的筛选及其对重金属的吸附

应用与环境生物学报2008，14(5):650~653ChinJApplEnvironBiol=ISSN1006-687X2008-10-25DOI:10.3724/SP.J.1145.2008.00650高抗铜青霉菌的筛选及其对重金属的吸附*杜爱雪1曹理想2张仁铎1**(中山大学1环境科学与工程学院,2生命科学学院广州510275)ScreeningofPenicilliumStrainwithHighCopperResistanceandItsAdsorptionofHeavyMetals*DUAixue1,CAOLixiang2&ZHANGRenduo1**(1SchoolofEnvironmentalScienceandEngineering;2SchoolofLifeSciences,SunYat-SenUniversity,Guangzhou510275,China)AbstractAstrainofPenicilliumwithhighresistancetoheavymetals,especiallytocopper,wasisolatedfromcopperminingsoil.ThetoleranceconcentrationsofthestraintoCu2+,Zn2+,Pb2+,Ni2+,Cr6+andCd2+were150,150,35,15,5and5mmol/L,respectively.Underthestressof40mmol/LCu2+,theoptimaltemperatureandpHforthestraingrowthwere30℃and7.0.Itsbestcarbonandnitrogensourceswerefarina,peptoneor(NH4)2SO4,anditsgrowthspeedcouldbeeffectivelyacceleratedbyaddingoxalicacidorcitricacid.Theanalysesbasedonatomicabsorptionindicatedthat98%ofCu2+wasadsorbedfromcoppersolutionsatpH5.0andwith10mg/LofCu2+in45minutes.InasolutionwithpH6.0and100mg/Lofeachheavymetalion,theadsorptionsofCu2+,Zn2+,Pb2+,Cr6+,Ni2+andCd2+were22.8,8.9,18.2,4.3,8.4,and5.5mg/g,respectively.TheexistenceofCu2+inthesolutioncouldinhibittheadsorptionsofZn2+,Pb2+,Ni2+andCd2+bythestrain.TheadsorptionofCr6+waspromotedslightlywhenitwascompoundedwithCu2+,buttherewasstillnosignificancebetweenthesetwoadsorptionquantities.Fig3,Tab2,Ref22KeywordsPenicillium;heavymetal;heavymetalresistance;adsorptionCLCX172摘要从一种铜矿尾矿土壤中分离得到一株高抗重金属盐的青霉菌株，其对Cu2+、Zn2+、Pb2+、Ni2+、Cr6+、Cd2+的抗性水平分别为150、150、35、15、5、5mmol/L.在40mmol/LCu2+的胁迫下，该菌株的最适生长温度为30℃，最适pH为7.0.该菌以淀粉为碳源、以蛋白胨或硫酸铵为氮源时生长速度最快，草酸和柠檬酸也可有效促进菌体的生长.原子吸收结果表明，在pH5.0、Cu2+10mg/L的铜溶液中，菌株45min内可吸附98%Cu2+；pH6.0、金属离子浓度为100mg/L时，菌体对Cu2+、Zn2+、Pb2+、Ni2+、Cr6+、Cd2+的吸附量分别为22.8、8.9、18.2、8.4、4.3、5.5mg/g干菌体，同时Cu2+的存在抑制了菌体对Zn2+、Pb2+、Ni2+、Cd2+的吸附，然而能在小范围内促进对Cr6+的吸附，但促进程度不显著.图3表2参22关键词青霉菌；重金属；重金属抗性；吸附CLCX172收稿日期:2007-07-09接受日期:2007-11-14*国家自然科学基金资助项目(No.50779080)和广东省基金自然科学基金团队资助项目(No.06202438)SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.50779080)andtheTeamworkProjectoftheNaturalScienceFoundationofGuangdong,China(No.06202438)**通讯作者Correspondingauthor(E-mail:[e-mail])铜作为对生物影响最大、最直接的金属元素之一，是有机体生命活动所必需的微量元素，是许多酶参与解毒、氧化磷酸化等生化过程不可缺少的部分[1].铜具有两种氧化态(Cu+、Cu2+)以及它的氧化还原电位范围较广(200~800mV)，在许多氧化还原反应中对许多金属酶的活性有重要的影响[2].铜还可以作为电子传递媒介对各种氧化还原反应起催化作用.但也正因为铜具有这些性质，它可以通过氧化蛋白质，分裂DNA和RNA以及通过脂肪过氧化作用等严重损害细胞[3].此外，铜可以和组氨酸、半胱氨酸等紧密结合，使这些蛋白质失去活性[4].因此，铜对生物有机体有益、有害的双重作用严格要求生物生存环境中铜含量维持在较低水平(一般为1~10µmol).然而，现实环境中的铜含量已远远超过了生物所能耐受的范围，成为亟需解决的问题，其中利用微生物来减轻或消除铜污染在国内外已有许多报道[5~8].研究也表明，某些微生物在一定程度上可以通过各种途径维持细胞内铜浓度的平衡[9,10].然而，当环境中铜浓度较高时，绝大部分微生物难以生存.本文作者从一种铜矿尾矿土壤中分离到了一株高抗铜兼抗其它重金属盐的菌株，并就其对Cu2+及其他金属离子的吸附特性进行了初步研究，以寻找能更有效修复铜污染的微生物.1材料与方法1.1抗Cu2+微生物的筛选取土壤样本制备成10-4、10-5、10-6三种不同浓度的土壤稀释液，移取每种浓度1mL到于121℃下高温灭菌20min的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)表面，涂布，30℃下恒温培养，根据培养基中长出的菌落形态、颜色等，挑选不同的菌落转6515期杜爱雪等：高抗铜青霉菌的筛选及其对重金属的吸附接到含5mmol/LCu2+的PDA中，培养1wk后，只有1株菌存活，选择该菌为实验用菌，并进一步提高Cu2+浓度至其不能长成明显的菌落以确定该菌最大抗铜能力.实验中将该菌接种到含150mmol/LCu2+的PDA中，该菌能形成菌落，但菌落直径明显缩小，超过150mmol/L，该菌培养25d后也不能形成明显的菌落.因此，确定该菌最高抗Cu2+浓度为150mmol/L.按以上方法检测分离到的能抗150mmol/LCu2+的菌株对Zn2+、Pb2+、Ni2+、Cr6+、Cd2+等金属离子的抗性：将菌株分别接种于含一定浓度Zn2+、Pb2+、Cr6+、Ni2+、Cd2+的各个PDA平板中，逐步提高其浓度直至不能明显形成菌落.各重金属离子的存在形态为：Cu2+－CuCl2·2H2O，Zn2+－ZnCl2，Cr6+－K2CrO4，Pb2+－Pb(NO3)2，Ni2+－NiCl2·6H2O，Cd2+－CdCl21.2菌株的鉴定用载玻片培养法进行真菌培养，依据分生孢子形状及其着生方式等，按魏景超[11]方法鉴定菌种属.1.3培养条件温度：将菌种接种到含40mmol/LCu2+的PDA，25、30、35℃下分别培养8d，测定菌落直径.酸碱度：接菌种到含40mmol/LCu2+，pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的PDA，30℃培养12d后测定菌落直径.营养成分：在查氏培养基(Cu2+浓度为40mmol/L)中采用不同的碳、氮源，接种分离到的菌株，30℃恒温培养12d后测定各营养条件下菌落的生长直径.实验中采用的碳源有葡萄糖、淀粉和95%乙醇，氮源有硝酸钠、氯化铵、硫酸铵和蛋白胨.具体设计见表1.另外，实验还在培养基中分别额外加入了0.005g草酸和0.02g柠檬酸.其中，原始查氏培养基的成分为葡萄糖30g、硝酸钠2g、MgSO40.025g、琼脂1.0g、蒸馏水50mL、K2HPO40.05g、FeSO40.0005g.1.4菌体对铜及其他重金属离子的瞬时吸附取分生孢子接种于查氏培养基中，30℃摇床培养4d，用纱布收集一定量的菌丝体，高纯水洗涤数次，用滤纸吸干菌体明水，作为吸附用菌.设置起始Cu2+浓度分别为10、50、100、300、500mg/L的CuCl2溶液30mL于100mL的三角瓶中，pH5.0，加入0.85g左右吸附用菌，用玻棒充分搅散菌群，30℃，150r/min吸附45min后过滤，用原子吸收分光光度计测定上清液中铜离子残留量，同时收集烘干菌体，计算铜的吸附量，并按0.05g干菌重计算铜的吸附率.另外分别测定pH值对Cu2+吸附的影响、菌体对Zn2+、Pb2+、Cr6+、Ni2+、Cd2+的吸附以及Cu2+和另一金属离子共存下的吸附情况：配制Cu2+浓度为100mg/L的CuCl2溶液30mL，调节pH分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0；取100mg/LZn2+、Pb2+、Cr6+、Ni2+、Cd2+溶液30mL，pH6.0；设置1)100mg/LCu2+和100mg/LZn2+，2)100mg/LCu2+和100mg/LPb2+，3)100mg/LCu2+和100mg/LCr6+，4)100mg/LCu2+和100mg/LNi2+的复合重金属离子溶液30mL，pH6.0，在上述各溶液中分别加入0.85g吸附用菌，30℃，150r/min吸附45min后过滤，用原子吸收分光光度计测定上清液中铜离子残留量，同时收集烘干菌体，计算菌体对各金属离子的吸附量和吸附率.以上每组实验均设3次重复.2结果2.1高抗Cu2+及其它重金属离子的青霉菌株分离到一株高抗铜兼抗其他重金属盐的菌株，经鉴定为青霉菌(Penicilliumsp.)，其对Cu2+、Zn2+、Pb2+、Ni2+、Cr6+、Cd2+的最高抗性水平分别为150、150、35、15、5、5mmol/L.2.2温度、pH、营养成分对青霉菌生长的影响在40mmol/LCu2+介质中，菌体在25、30、35℃下生长8d后的菌落直径分别为1.5、1.6、0.7cm，因此该菌的最适生长温度为30℃.同时，在Cu2+为40mmol/L时，菌株在pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0下的生长直径分别为1.2、1.7、1.7、1.8、1.4、1.3cm，因此该菌株在酸碱条件下都能较好地生存，其中最适生长pH为7.0，即中性条件更有利于青霉菌在Cu2+胁迫下的生长.不同的营养成分对生长于一定量Cu2+环境中的青霉菌的生长有较大影响(图1).在氮源同为硝酸钠时，青霉菌以淀粉为碳源时生长速度最快，其次是葡萄糖；而在碳源同为葡萄糖时，青霉菌以硫酸铵或蛋白胨为氮源时生长速度最快，其表1查氏培养基的营养组分Table1IngredientsofCzapek-Doxmedium成分Ingredient碳源Carbonsource(m/g)氮源Nitrogensource(m/g)碳源Carbonsources葡萄糖Dextrose1.5NaNO30.1淀粉Starch1.5NaNO30.195%乙醇Ethanol1.3mLNaNO30.1氮源Nitrogensources葡萄