共代谢条件下光合细菌对2氯苯酚的生物降解

共代谢条件下光合细菌对2鄄氯苯酚的生物降解*董怡华1,2摇胡筱敏2**摇和英滇2摇李摇亮2(1沈阳大学生物与环境工程学院,沈阳110044;2东北大学资源与土木工程学院,沈阳110004)摘摇要摇光合细菌PSB鄄1D不能利用2鄄氯苯酚(2鄄CP)作为唯一的碳源和能源.选用苹果酸、丙酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、苯酚、葡萄糖和可溶性淀粉等7种不同碳源作为光合细菌PSB鄄1D降解2鄄CP的共代谢基质,考察了在黑暗好氧培养条件下,不同共代谢基质对PSB鄄1D生长及降解2鄄CP效果的影响.结果表明:葡萄糖能够很好地促进PSB鄄1D的大量繁殖,提高降解效果,缩短降解周期,为最佳共代谢基质.对葡萄糖的投加浓度进行了优化,当葡萄糖的投加浓度为3g·L-1时,菌株PSB鄄1D培养168h后的菌体生长浓度驻D560为1郾749,2鄄CP的半衰期为3郾9d,降解速率常数为0郾00864h-1.采用SDS鄄PAGE对微生物全细胞蛋白质进行分析发现,在共代谢过程中当菌株PSB鄄1D利用葡萄糖作为底物提供能源和碳源时,可诱导产生2鄄CP特异性降解酶.关键词摇光合细菌摇2鄄氯苯酚摇共代谢摇生物降解摇降解动力学文章编号摇1001-9332(2011)05-1280-07摇中图分类号摇X703.1摇文献标识码摇ABiodegradationofo鄄chlorophenolbyphotosyntheticbacteriaunderco鄄metabolism.DONGYi鄄hua1,2,HUXiao鄄min2,HEYing鄄dian2,LILiang2(1CollegeofBiologicalandEnvironmentalEngineering,ShenyangUniversity,Shenyang110044,China;2CollegeofResourcesandCivilEngi鄄neering,NortheasternUniversity,Shenyang110004,China).鄄Chin.J.Appl.Ecol.,2011,22(5):1280-1286.Abstract:PhotosyntheticbacterialstrainPSB鄄1Dcannotutilizeo鄄chlorophenol(2鄄CP)asthesolecarbonsourceforenergy.Inthispaper,differentcarbonsources(malicacid,sodiumpropionate,sodiumacetate,sodiumcitrate,phenol,glucose,andsolublestarch)weretakenastheco鄄metabo鄄lismsubstratestostudytheireffectsonPSB鄄1Dgrowthand2鄄CPdegradationundertheconditionofaerobiccultureindarkness.Amongthesubstrates,glucosewasmostefficient,whichpromotedthereproductionofPSB鄄1D,enhancedthe2鄄CPdegradationefficiency,andshortenedthedegradationperiod.Theoptimizationexperimentofaddedconcentrationofglucoseshowedthatwhentheaddedglucoseconcentrationwas3g·L-1,thePSB鄄1Dcellconcentration驻D560after168hculturewas1郾749,thehalf鄄timeof2鄄CPwasshortenedto3郾9d,andthedegradationrateconstantwasin鄄creasedto0郾00864h-1.TheSDS鄄PAGEanalysisonthetotalmicrobialcellularproteinshowedthattakingglucoseastheco鄄metabolismsubstrate,PSB鄄1Dcouldinduceaspecific2鄄CP鄄degradingen鄄zyme.Keywords:photosyntheticbacteria;o鄄chlorophenol;co鄄metabolism;biodegradation;degradationkinetics.*国家水体污染控制与治理科技重大专项(2008ZX07208鄄009)资助.**通讯作者.E鄄mail:[e-mail]2010鄄10鄄09收稿,2011鄄02鄄27接受.摇摇氯酚类化合物(CPS)被广泛用作木材的防腐剂及农药、树脂、染料和医药的合成原料,并且是杀菌剂、除草剂和热交换剂等的主要成分[1-4].氯酚类化合物的广泛使用,使得大量的CPS污染物进入环境中.这类化合物不仅对水生生物的毒性很强[5],易于在生物体内富集和累积,而且很难通过自然水体中的微生物降解作用消除其影响[6-8].因此,有关环境中氯酚类化合物去除方法的研究一直是学术界的研究热点和难点[9-10].对此类化合物的主要去除方法可分为物理法[11]、化学法[12]、物理化学法[13]和生物降解法[14-15],而利用人工强化的生物降解技术是目前效果较好的方法之一.其中,通过共代谢作用来转化或降解氯酚类化合物是生物处理方法中最有前景的技术之一,这种技术将成为有效的新兴水处理方式.应用生态学报摇2011年5月摇第22卷摇第5期摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇ChineseJournalofAppliedEcology,May2011,22(5):1280-1286共代谢是微生物降解难降解有机物的一种重要的代谢方式[16].共代谢又称协同代谢,最早由Lead鄄better和Foster[17]于1959年提出,其定义为在生长基质存在时,对非生长基质的氧化.研究某一高效菌株对特定有机物在共基质条件下的降解不仅可为生物处理污水技术提供理论依据,而且对实际水处理工程具有指导意义.目前,利用共代谢基质降解2鄄氯苯酚(o鄄chlorophenol,2鄄CP)的环境微生物有恶臭假单胞菌(Pseudomonasputidasp.)[18]、洋葱假单胞菌(Ps.cepacia)[19]、嗜热梭菌(Clostridiumsp.)[20]、产碱杆菌(Alcaligenessp.)[20]、罗尔斯通氏菌(Ralsto鄄niasp.)[20]、固氮菌(Azotobactersp.)[20]等.但利用能够随环境变化而灵活改变代谢途径的光合细菌来进行共代谢降解2鄄CP的研究却未见报道.本研究考察了在黑暗好氧条件下,不同共代谢基质对光合细菌生长和降解2鄄CP效果的影响,通过对2鄄CP降解曲线进行动力学拟合,确定了最佳共代谢碳源及其最佳投加浓度.在此基础上,探索了2鄄CP共代谢降解关键酶的诱导机制,以期为2鄄CP的快速降解提供科学依据,也为降解其他有毒难降解有机物寻找高效的共代谢基质提供思路.1摇材料与方法1郾1摇试验试剂2鄄氯苯酚(2鄄CP,纯度99%),购于国药集团化学试剂有限公司;葡萄糖、苯酚、可溶性淀粉、丙酸钠、柠檬酸钠、苹果酸钠等均为分析纯(AR),购于天津市博迪化工有限公司;甲醇为色谱纯,购于FisherScientific.1郾2摇供试菌株从某农药厂排污口下游水体浅层底泥中分离、筛选、驯化、紫外线诱变得到一株可在含高浓度2鄄CP培养基中生长,且对2鄄CP降解性能稳定的光合细菌作为降解菌株,编号为PSB鄄1D(图1).经鉴定,该菌图1摇菌株PSB鄄1D的电镜扫描图Fig.1摇SEMphotoofbacteriaPSB鄄1D.为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris),16SrDNA序列为GenBankAccessionNo.HM068966.1郾3摇培养基种子液培养基:(NH4)SO40郾06g,CH3COONa3郾5g,MgSO40郾258g,CaSO40郾156g,KH2PO40郾6g,K2HPO40郾4g,酵母膏0郾02g,微量元素液1mL,蒸馏水1000mL,pH7郾0~7郾2.在上述液体培养基中加入2%~3%的琼脂即得相应的固体培养基.摇摇无机盐培养基:MgSO40郾258g,CaSO40郾156g,KH2PO40郾6g,K2HPO40郾4g,微量元素液1mL,蒸馏水1000mL,pH7郾0~7郾2.其中,微量元素液组成:H3BO31郾5g,ZnSO4·7H2O0郾06g,MnSO4·H2O0郾8g,CuSO4·5H2O0郾1g,CoSO4·7H2O0郾01g,(NH4)6Mo7O24·4H2O0郾2g,蒸馏水1000mL.1郾4摇菌株PSB鄄1D的种子菌液培养将保存于固体培养基中的PSB鄄1D菌落用接种环挑取并接种至含2鄄CP质量浓度为50mg·L-1的100mL种子液培养基中,将培养基倒入无菌锥形瓶中进行黑暗好氧培养.待菌体培养至指数生长期后期(约70h),以10%的接种量接种至装有200mL无菌种子液培养基(2鄄CP质量浓度为50mg·L-1)的锥形瓶中,再次进行黑暗好氧培养70h,以此培养液为PSB鄄1D种子菌液.1郾5摇菌株PSB鄄1D的黑暗好氧培养条件用灭菌后的八层纱布将装有培养液的锥形瓶瓶口包扎好.用黑布将锥形瓶包严后,细绳绑上.将锥形瓶放入HZQ鄄C型空气浴振荡器中于30益(130依5)r·min-1的条件下进行黑暗振荡培养,振荡器漏光处用黑布封上.1郾6摇不同共代谢基质对PSB鄄1D生长及其降解2鄄CP的影响试验用无菌移液管向90mL含2鄄CP质量浓度为50mg·L-1的无菌无机盐培养基中接种PSB鄄1D种子菌液10mL,在每个无机盐培养基中添加0郾06g的(NH4)2SO4和0郾02g的酵母膏作为氮源,然后在培养基中分别加入不同的含碳基质,即葡萄糖、可溶性淀粉、丙酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、苯酚、苹果酸,为保证所投加的基质含碳量一致,投加浓度值分别为2郾81、2郾31、2郾73、3郾50、4郾18、1郾34、2郾86g·L-1,并且以无共代谢基质为对照(CK).为保证试验条件的一致性,所有接种的种子菌液都取自同一瓶种子培养液(每10mL种子菌液的驻D560约为1郾277左右).每组试验均设1组平行和1组无菌对照.将配置好18215期摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇董怡华等:共代谢条件下光合细菌对2鄄氯苯酚的生物降解摇摇摇摇摇的100mL培养液装入250mL无菌锥形瓶中进行黑暗好氧培养,每隔一定时间取样,立即测定菌体生长浓度(驻D560)和培养液的2鄄CP质量浓度.1郾7摇不同质量浓度的葡萄糖对PSB鄄1D生长及其降解2鄄CP的影响试验用无菌移液管向90mL含2鄄CP质量浓度为50mg·L-1的无菌无机盐培养基中接种PSB鄄1D种子菌液10mL,在每个无机盐培养基中添加0郾06g的(NH4)2SO4和0郾02g的酵母膏作为氮源,然后在培养基中分别加入不同质量浓度的葡萄糖,分别为0、1郾0、1郾5、2郾0、2郾5、3郾0、3郾5、4郾0g·L-1.为保证试验条件的一致性,所有接种的种子菌液都取自同一瓶种子培养液(每10mL种子菌液的驻D560约为1郾314左右).每组试验均设1组平行和1组无菌对照.将配置好的100mL培养液装入250mL无菌锥形瓶中进行黑暗好氧培养,每隔一定时间取样,立即测定菌体生长浓度(驻D560)和培养液的2鄄CP质量浓度.1郾8摇分析方法菌体生长浓度的测定:采用WTWSpec鄄troFlex6600紫外鄄可见分光光度计,于560nm固定波长下测定菌的光密度值(D560).菌株的生长浓度为:驻D560=D560忆-D560,其中驻D560表示培养一定时间后菌株PSB鄄1D的生长浓度;D560表示PSB鄄1D培养液的初始D560;D560忆