光合生产植物天然产物的代谢工程蓝藻研究现状

专题光合生产植物天然产物的代谢工程蓝藻研究现状51（1月）光合生产植物天然产物的代谢工程蓝藻研究现状倪俊，陶飞，许平上海交通大学生命科学技术学院，上海　200240摘要：蓝藻是植物天然产物光合生产的理想平台，它们不仅具有遗传背景简单、营养需求低和高CO2固定效率等优势，还可以解决生物法制备天然产物所面临的植物源酶适配性、还原力供应和对昂贵底物依赖等限制因素。介绍了近年来利用蓝藻光合生产植物天然产物及前体物质的昀新研究进展和发展趋势，分析了蓝藻生产天然产物的优势，为进一步开发天然产物的光合平台提供指导，并对产业化发展方向进行了展望。关键词：蓝藻；植物天然产物；合成生物学；代谢工程；光合微生物DOI:10.3969/j.issn.1674-0319.2017.01.008　　许平，微生物代谢国家重点实验室副主任，上海交通大学特聘教授，美国国家发明家科学院（NAI）院士，美国生物医学工程院（AIMBE）会士。担任SCI期刊如《EngineeringinLifeSciences》编辑和《ScientificReports》、《ProcessBiochemistry》、《BioprocessandBiosystemsEngineering》、《Biodegradation》等杂志的编委。近年主要从事环境与工业微生物技术的研究，在污染环境的生物修复天然食品添加剂发酵和生物催化生产技术等方面取得多项原创性的重要成果。E-mail：[e-mail]植物次生代谢物在其生长发育、环境适应、抵御病虫害等方面发挥着重要作用，根据其合成路径的差异，可以分为生物碱类、萜类、苯丙烷类。这些天然产物通常具有特殊生物活性，被广泛应用于医药、轻化工、食品及农药等领域[1]。目前有75%抗感染性疾病药物和超过60%的抗癌药来源于天然产物或其类似物，这些天然产物大多属于植物次生代谢物[2]。如紫杉醇是目前昀有效的天然抗癌药物之一，青蒿素是一种抗疟疾药。植物天然产物主要从天然植物中提取，但是由于种植面积有限、生长慢、化合物含量低和分子类似物多等限制，使得产量难以满足市场需求[3]。化学合成法产量较高，但副产物多导致分离相对困难，生产过程也会给环境带来较大压力[4]。同时，化学法获得的天然产物通常价格较低，如合成香兰素一般在15美元/千克左右，而天然香兰素价格约比其高300倍[5]。合成生物学和代谢工程是未来生物技术经济的主要推动力，为生物法制备天然产物带来了新契机，其具有环境友好、生产周期短、易于工业化放大生产、产量相对较高、产物易于分离纯化和不依赖于气候、土地等诸多优势[6]。生物法制备植物天然产物通常依赖昂贵的前体物质，较高底物成本限制了其应用。近年，在微生物中人工设计合成途径，利用葡萄糖第一作者：倪俊，微生物学博士，上海交通大学微生物代谢国家重点实验室博士后。主要从事高值植物天然产物微生物发酵和光合生产的研究。E-mail：[e-mail]专题（1月）52等廉价碳源合成植物天然产物已成为现实[7]。然而，植物源酶适配性、还原力和能量供应等限制因素的存在，使得生产效率并不高。同时，底物成本依然是生产成本不可忽视的部分。因此，尽管生物法制备香兰素发展较快，但实现经济可持续的生产仍是巨大的挑战，而光合微生物的引入为天然产物生产带来了新契机。1　蓝藻是植物天然产物生产的理想宿主光合微生物蓝藻用于光合生产有许多优势，如细胞结构简单、易于基因操作、生长速度较快、不受气候和土地限制等[8]。尤为重要的是，蓝藻具有较高的太阳能利用效率，比大多数微生物的营养需求低，仅需要太阳能、水、CO2、N和P等无机营养，不依赖于有机碳源[9]。这使得其得到广泛的关注，并用于生产生物燃料和大宗化学品，如正丁醇、异丁醛、2,3-丁二醇、脂肪酸和异丙醇等[10]。蓝藻在生产植物天然产物方面有着许多与生俱来的独特优势。在植物天然产物的合成过程中，涉及到许多植物酶，其中细胞色素P450单加氧酶对苯丙烷类、生物碱类和萜类等天然产物的合成至关重要。然而，许多真核生物的P450单加氧酶都是膜结合蛋白，难以在大肠杆菌等大多数原核微生物中异源表达，因为这类微生物缺少内生的膜系统[11]。蓝藻与大多数原核微生物不同，其细胞内拥有类囊体膜系统，使得植物源P450单加氧酶可以功能性的表达。先前的研究也证实了这一点，Xue等[12]在蓝藻Synechocystissp.PCC6803中功能性表达了拟南芥（Arabidopsisthaliana）P450对香豆酸-3-羟化酶，成功将对香豆酸转化为咖啡酸。经过免疫印迹分析，发现对香豆酸氢化酶定位于工程菌的类囊体。Ni等[13]在蓝藻SynechococcuselongatusPCC7942中表达了相同的P450单加氧酶，利用分离出的类囊体测定了对香豆酸氢化酶的酶活，进一步确定了植物P450在蓝藻中的功能性表达。值得注意的是，蓝藻有许多代谢途径与植物相近，在大多数蓝藻基因组中也存在P450序列，如SynechocystisPCC6803中的cyp120A1/slr0574[14]，Anabaenasp.PCC7120中有6个P450基因[15]。此外，植物天然产物的合成通常需要消耗大量还原力和能量，而大肠杆菌等大多数微生物中还原力和能量不足以支撑这些天然产物的合成。但蓝藻光合作用的效率要高于陆生植物，可以利用太阳能产生大量的ATP和NADPH，从而利用这些化学能和还原力推动许多天然产物的合成[16]。2　利用蓝藻生产植物天然产物基于合成生物学和代谢工程的理念，在光合微生物中可以设计和重构植物天然产物的合成途径，已经成功生产了多种植物天然产物及前体物质（表1）。这些外源途径通常基于蓝藻的光合作用，与初级代谢相连接（图1）。2.1　萜类化合物萜类化合物是异戊二烯（C10H16）的聚合体及其含氧的饱和程度不等的衍生物，是许多中草药中的有效成分，同时也是化妆品和食品工业不可缺少的原料。其中，萜类的单体异戊二烯是重要的工业原料，可通过聚合合成橡胶、塑料以及萜烯类化合物[32]。Lindberg等[17]在蓝藻Synechocystissp.PCC6803中表达了葛麻姆（Puerariamontana）中的异戊二烯合酶基因（ispS），成功获得了异戊二烯，通过对ispS进行密码子优化和启动子psbA2的使用，使得产率达到2.1μg/[（gDCW）·h]。Bentley等[18]在Synechocystissp.PCC6803中表达了粪肠球菌（Enterococcusfaeca-lis）和肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）中甲羟戊酸途径（MVApathway）的7个基因，使碳流更多引向异戊二烯的前体异戊烯二磷酸（IPP）和二甲基烯丙基二磷酸酯（DMAPP）。异源表达异戊二烯合酶基因后，相比于仅含有自身非甲羟戊酸途径（MEPpathway）的Synechocystissp.PCC6803，MVA途径的引入可以使得异戊二烯的光合产量提高约2.5倍。Gao等[19]将不同来源的异戊二烯合酶引入S.elongatusPCC7942，发现蓝桉树（Eucalyptusglobulus）来源的ispS比其他来源的基因在蓝藻中可溶性表达更好。随后，他们利用动态代谢流分析揭示MEP途径的瓶颈，构建了异戊二烯焦磷酸异构酶（IDI）和IspS融合酶并高表达了1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶基因（dxs）和4-羟基-3-甲基-2-烯基二磷酸合酶基因（ispG），重组菌株可以在21d光合生产1.26g/L异戊二烯。柠檬烯是一种重要的专题光合生产植物天然产物的代谢工程蓝藻研究现状53（1月）萜类香料，并且具有显著的生物活性，用途广泛。Kiyota等[20]在Synechocystissp.PCC6803中表达了荆芥（Schizonepetatenuifolia）的柠檬烯合酶基因（lms），重组菌株每天可以光合生产41μg/L柠檬烯。通过过表达MEP途径中的dxs、crtE和ipi基因来增加柠檬烯合成的底物牻牛儿基焦磷酸（GPP）的供应，使得柠檬烯的光合产量提高了1.4倍。Halfmann等[21]在Anabaenasp.PCC7120中表达了北美云杉（Sitkaspruce）的柠檬烯合酶基因，同时引入了DXP操纵单元（dxs-ipphp-gpps）来高表达MEP途径的限速酶，重组菌株的柠檬烯产率可达到3.6μg/（LO.D.h左右。Davies等[22]在Synechococcussp.PCC7002中表达了留兰香（Menthaspicata）的柠檬烯合酶基因或者巨冷杉（Abiesgrandis）的α-红没药烯合酶基因（bis），分别可以得到4mg/L的柠檬烯和0.6mg/L的红没药烯，生产过程中，十二烷膜的使用可能会解除反馈抑制，使得柠檬烯和红没药烯的产量进一步提高。Bentley等[23]在Synechocystissp.PCC6803中表达密码子优化后的薰衣草（Lavandulaangustifolia）β-水芹烯合酶基因，重组菌可以光合合成133mg/gDCW水芹烯。Formighieri等[24]将β-水芹烯合酶与占细胞内总蛋白20%的藻青蛋白β亚基在Synechocystissp.PCC6803中进行融合表达，同时引入甲羟戊酸途径和牻牛儿基焦磷酸合酶，使得进入萜类合成途径的碳流增加，重组菌可以在48h内光合生产10mg/gDCW水芹烯。Reinsvold等[25]将青蒿（Artemisiaannua）的β-石竹烯合酶基因在Synechocystissp.PCC6803中表达，光合合成了约4mg/gDCW的石竹烯。Halfmann等[26]在Anabaenasp.PCC7120中表达了密码子优化的法呢烯合酶基因，光合生产了法呢烯，产率达到（69.1±1.8）μg/（LO.D.d）。Kudoh等[27]在Syn-echocystissp.PCC6803中过表达了1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶基因，使得多烯色素类胡萝卜素的含量比野生型菌株提高了1.5倍。表1　基因工程蓝藻生产的植物天然产物产物产量宿主参考文献异戊二烯50μg/［（gDCW）d］Synechocystissp.PCC6803[17]125μg/［（gDCW）d］Synechocystissp.PCC6803[18]60mg/LdS.elongatusPCC7942[19]柠檬烯56μg/LdSynechocystissp.PCC6803[20]3.6μg/LO.D.hAnabaenasp.PCC7120[21]50μg/LhSynechococcussp.PCC7002[22]红没药烯7.5μgLhSynechococcussp.PCC7002[22]β-水芹烯133mg/gDCWSynechocystissp.PCC6803[23]5mg/［（gDCW）d］Synechocystissp.PCC6803[24]β-石竹烯4mg/gDCWSynechocystissp.PCC6803[25]法呢烯69.1±1.8μg/LO.D.dAnabaenasp.PCC7120[26]类胡萝卜素8.4mg/gDCWSynechocystissp.PCC6803[27]咖啡酸7.2mg/LSynechocystissp.PCC6803[12]4.7mg/LS.elongatusPCC7942[13]对香豆酸82.6mg/LSynechocystissp.PCC6803[28]128.2mg/LS.elongatusPCC7942[13]阿魏酸6.3mg/LS.elongatusPCC7942[13]柚皮素4.6mg/LS.elongatusPCC7942[13]白藜