光合细菌的筛选及对中华鳖养殖水质和生产效益的影响

光合细菌FP04的筛选及对中华鳖养殖水质和生产效益的影响摘要：从入海排污口污泥中筛选到一株有较强净化养殖水质能力的光合细菌，初步鉴定其为红螺菌，命名为FP04。实验室试验表明，FP04能有效降低养殖污水的CODcr含量。在中华鳖的养殖水体中加入不同浓度的FP04，结果与对照组比较，FP04可显著降低养殖水体中的氨氮和化学需氧量，并可减少甲鱼病害发生，提高甲鱼养殖成活率和增重率，其中以养殖水体中FP04浓度为9×104CFU/mL的效果最好，成活率和增重率分别提高14%和31%。关键词：光合细菌；筛选；甲鱼；养殖水质；生产效益随着水产养殖业的发展，养殖密度不断的提高，养殖用水严重污染、池塘逐年老化、滥用药物导致抗药性的产生等问题，威胁健康养殖的发展。近年来，生物制剂特别是微生态制剂的应用备受关注，并在水产养殖中广泛应用。光合细菌（photosyntheticbacteria，简称PSB）是广泛存在于自然界、具有原始光能合成体系、能在厌氧条件下进行不放氧光合作用的原核生物[1]。光合细菌对环境的适应力很强，在生长过程中能分解池塘中的有机物，并能吸收水体中的氨态氮、硫化氢、亚硝酸盐等有害物质，从而达到净化水质的作用[2，3]，同时光合细菌也具有抑制有害病菌滋生的作用[4，5]。实验室在福建龙海水产养殖基地入海排污口的污泥中筛选到一株活性较高的光合细菌FP04。在甲鱼养殖过程中，投放不同浓度的FP04通过检测养殖池水中的氨氮（NH4+-N）和化学需氧量（COD）动态变化，并测量甲鱼的增重率和成活率，以此评估FP04在甲鱼养殖上的应用价值，为FP04的开发利用提供科学依据。1材料与方法1.1材料1.1.1培养基与菌源选择培养基主要成份：NH4Cl1.0g，CH3COONa3.5g，MgCl20.1g，CaCl20.1g，KH2PO40.6g，K2HPO40.4g，酵母膏0.1g，琼脂20g（固体培养基用），水1000mL，调整pH值7.2。菌源筛选采自福建龙海水产养殖基地入海排污口的污泥。1.1.2甲鱼养殖甲鱼养殖在福建泉州希望甲鱼场，共12口水泥池，分2批平行排列，编号1#至12#。每口池面积12m2，水深50cm，池底铺沙5~8cm，挂网袋（约5个/m2），罗茨鼓风机增氧，塑料薄膜覆盖保温，锅炉加温。养殖甲鱼品种为中华鳖（Trionyxsinensis），规格50~60g/只，无异常现象。1.2方法1.2.1菌种的富集与分离取10g污泥于500mL三角瓶中，加液体筛选培养基至瓶颈，液面注入灭菌液体石蜡以隔绝空气，28℃、2000lx光照条件下培养7~10d。当瓶中液体呈现红色时，取1mL液体进行梯度稀释，涂布固体培养基平皿，石蜡封闭培养皿，30℃、2000lx光照条件下培养7d，挑取其中呈红色的单菌落进行划线分离。1.2.2菌种初步鉴定根据《伯杰氏细菌鉴定手册》中细菌形态和生理生化特性等对分离出的菌株进行鉴定[6]。挑取单菌落送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行菌株的16SrDNA测序。1.2.3菌株对养殖污水的净化效果试验分别试验FP04菌株在光照厌氧和黑暗好氧条件下对养殖污水的净化效果，养殖污水取自养殖区内罗非鱼高密度养殖池。光照厌氧培养，采用250mL容量瓶加资助项目：厦门海洋研究开发院[K10102（1）]作者简介：方卫东（1977-），男，工程师，从事海水养殖技术及动物营养研究.E-mail:[e-mail]通讯作者：徐长安，高级工程师.E-mail：[e-mail]：10.3969/j.isssn.1004-2091.2012.04.004水产养殖JournalofAquacultureVol.33，No.4Apr.1，2012第33卷第4期2012年4月1日100mL养殖污水，按5%的接种量接入对数生长期FP04菌液，液体石蜡封口，28℃、2000lx光照厌氧条件下培养72h。黑暗好氧培养，采用250mL三角瓶中加100mL养殖污水，按5%的接种量接入对数生长期FP04菌液，纱布封口，28℃、120r/min黑暗条件下震荡培养72h。同时设定不加菌液的养殖污水作为对照，每组3个重复，分别测定起始时刻和72h时刻养殖污水的CODcr，计算不同条件下光合细菌FP04对养殖污水中CODcr的去除率。1.2.4菌液浓度对养殖水体化学需氧量（CODcr）、氨氮（NH4+-N）含量及甲鱼生长的影响试验12口池随机分为G1、G2、G3和G4不同菌液浓度组，每组2个平行，5#和12#池为对照组。每池投放甲鱼苗360只（每平方米30只），规格55g/只。试验组投放FP04，各组养殖水体中FP04浓度分别为G1：9.0×102CFU/mL；G2：9.0×103CFU/mL；G3：9.0×104CFU/mL；G4：9.0×105CFU/mL。每周追加投放1次，对照组不投放FP04。试验持续时间70d，试验开始和每隔7d检测各养殖池水体的CODcr和NH4+-N含量，每天检查甲鱼死亡情况，并记录数量。试验结束时，统计各组甲鱼的成活率和增重率。1.2.5饲养管理室内暗光充气养殖，每天8：00—9：00和15：00—16：00投喂2次，根据剩饵情况，调节投饵量。每天21：00—22：00巡池，检查是否有发病的甲鱼。试验全过程不大量换水，不添加抗生素。1.2.6分析方法CODcr测定采用重铬酸钾法[7]。NH4+-N的测定采用纳氏试剂法。数据处理用SPSS11.5软件进行统计分析。增重率（%）=（[试验末平均体重－试验初平均体重）/试验初平均体重]×100%。成活率（%）=试验末存活数/试验初总数量×100%。2结果2.1FP04的菌落形态及相关生物学特征经富集和分离，得到一株光合细菌，命名为FP04。对FP04进行28℃黑暗好氧培养，1周后在琼脂平板上形成的菌落呈浅红色，直径0.8cm左右，边缘整齐，中间隆起，表面光滑湿润，有光泽，菌体呈短杆状，二分分裂繁殖，革兰氏阴性，有鞭毛，运动活跃，可在光照厌氧或黑暗好氧条件下生长。2.2FP04菌株的初步鉴定结果根据FP04的细菌形态特征、生理生化反应结果，结合其16SrDNA测序，初步鉴定FP04为红螺菌属（Rhodospirillumsp.）。2.3菌株FP04对养殖污水的净化效果FP04在光照厌氧和黑暗好氧条件下经过72h对养殖污水的净化效果可以看出，菌株FP04在黑暗好氧条件下对养殖污水CODcr去除率为39.2%，在光照厌氧条件下对养殖污水CODcr去除率为61.7%，在光照厌氧条件下对养殖污水的净化效果要好于黑暗好氧条件，而对照组在相同条件下对CODcr的去除率只有20.3%和12.5%，明显低于光合细菌菌株FP04试验组（表1）。2.4不同菌液浓度对甲鱼养殖池水体CODcr和NH4+-N含量及甲鱼生长的影响2.4.1对水体中CODcr和NH4+-N的影响试验过程CODcr和NH4+-N的检测结果，对照组在试验前期CODcr和NH4+-N含量呈上升趋势，1周后CODcr升幅趋缓，而NH4+-N则一直缓慢上升。光合细菌投入后CODcr和NH4+-N含量第2周开始下降，各试验组含量检测均显著低于对照组（P0.05），其中G3试验组（9.0×105CFU/mL）下降幅度最大，对养殖水体中的CODcr和NH4+-N的净化效果最好（图1，2）。2.4.2对甲鱼增重率的影响各试验组增重率优试验条件起始CODcr（mg/L）72hCODcr（mg/L）CODcr去除率（%）光照厌氧266102±761.7对照组271165±539.2黑暗好氧269214±920.3对照组265232±712.5表1光合细菌菌株FP04对养殖污水净化效果图1FP04对养殖水体中CODcr的影响第4期方卫东，等光合细菌FP04的筛选及对中华鳖养殖水质和生产效益的影响13于对照组，G1试验组增重率为224%，略高于对照组196%，但差异不明显（P0.05）。G2、G3、G4试验组增重率均明显高于对照组（P0.05），其中G3试验组增重率最高，达到334%（图3）。2.4.3对甲鱼成活率的影响光合细菌对提高甲鱼的成活率有明显的效果。对照组的成活率为67%，试验组成活率均达到90%以上，明显高于对照组（P0.05）。G3试验组的成活率最高为96%。各试验组之间的成活率差异不明显（P0.05）（图4）。3讨论3.1光合细菌FP04对甲鱼养殖水体的净化作用温室集约化养殖甲鱼过程中，由于其空间封闭（保温需要）和水中分散投饵，使得养殖水质特别容易恶化，体现在水中的氨氮、亚硝酸盐、硫化氢等快速累积，化学需氧量等水质污染指标迅速升高。通常养殖户采用大量换水的方法进行养殖水质改善，但养殖水环境的激烈改变，往往引起甲鱼的应激反应，从而导致摄食迅速下降，同时因应激也使甲鱼的免疫力下降，病害因此大量暴发。光合细菌作为一种简便易得、效果优良的水质改良微生物制剂，已在水产养殖上得到广泛应用[8-10]。研究通过在养殖水体中施用FP04，结果表明养殖水质的代表性指标氨氮和化学需氧量在水中FP04达到9.0×102~9.0×105CFU/mL时，都可以得到显著性的下降，显示FP04可用于甲鱼的温室集约化养殖，用以降解养殖水体中的氨氮等有害物质，改善养殖水环境。3.2光合细菌FP04对提高甲鱼免疫力的作用及对甲鱼生产效益的影响光合细菌能提高养殖动物的免疫力，从而减少养殖动物病害发生，这方面的研究成果和生产实践已有很多的报道。王有基等[11]通过向养殖水体中施用光合细菌，结果显著增强了鲤鱼非特异性免疫功能，大大提高了鲤鱼抵抗病原微生物感染的能力。黄美珍[12]研究表明，在对虾池中使用光合细菌后，可以抑制弧菌的繁殖，促进对虾的生长，从而增强对虾的抗病能力，降低发病率和死亡率。本研究显示，在投放光合细菌FP04的试验组中，发病率极低，而没有投放光合细菌的对照组，试验过程持续发生了严重的腐皮病，因此光合细菌FP04对提高甲鱼免疫力、减少疾病发生的能力是肯定的。3.3光合细菌FP04对甲鱼生产效益的影响光合细菌可通过改良养殖水环境，增强养殖动物的免疫力，减少疾病发生，提高成活率，提高摄食率和饲料转化率，从而提高养殖动物的生产效益[13，14]。本研究也显示了FP04能显著提高温室集约化甲鱼养殖的生产效益，表现在甲鱼增值率和成活率的提高，其中增重率提高了31%，而成活率提高了14%。光合细菌除了通过改善养殖环境、间接提高养殖动物的生产效益外，其本身还是养殖动物优质、丰富的营养源，多种光合细菌可直接作为营养成分，添加到饲料中，从而直接提高养殖动物的生产图2FP04对养殖水体中氨氮的影响图3FP04对甲鱼增重率的影响图4光合细菌对甲鱼成活率的影响14水产养殖33卷TheisolationofPSBstrainFP04anditseffectonculturewaterqualityandharvestofTrionyxsinensisFangWeidong1，TangXu2，HeJianlin2，YuChaochao3，XuChangan2（1.FujianProvincialHaixin（Group）Co.,Ltd.Zhangzhou363102，China；2.TheThirdInstitutionofOceanography,SOA，Xiamen361005，China；3.CollegeofOcean&EarthSciences,XiamenUniversity,Xiamen361005，China）效益[15-17]。研究对FP04也进行了初步的营养含量检测，显示FP04含有丰富的氨基酸、蛋白质等营养元，其中蛋白质含量占到菌体干重的62%，而FP04为红螺菌属，位列农业部允许添加到饲料的光合细菌种属清单。实验室下一步将进一步对FP04作为饲料添加物开展研究。3.3菌种浓度对光合细菌FP04发挥作用的影响光合细菌作为水质改良剂，是通过其自身的繁殖、并在繁殖过程中利用了水中或池底底泥中的