污水处理工艺对氨氧化菌及细菌群落的影响1

中国环境科学2009,29(6)：622~628ChinaEnvironmentalScience污水处理工艺对氨氧化菌及细菌群落的影响王晓慧,文湘华*,杨宁宁,许美兰,丁鵾(清华大学环境科学与工程系,北京100084)摘要：采用针对氨氧化菌(AOB)功能基因氨单加氧酶(amoA)的末端限制性片段长度多态性技术(T-RFLP)、克隆测序等方法,研究了北京市2个污水处理厂的4个污水处理系统中AOB的群落结构,同时采用针对16SrRNA基因的T-RFLP技术分析了总细菌的群落结构.T-RFLP指纹图谱分析表明,4个污水处理系统中AOB的优势限制性片段(T-RF)均为291bp和354bp,细菌的优势T-RF为115,117,166,455,465,468,471,482,800,893bp等.说明污水处理工艺对系统中AOB及细菌的群落结构影响很小.对功能基因amoA的系统发育分析表明,4个污水处理系统中优势AOB均属于Nitrosomonaseuropaeacluster和Nitrosomonasoligotrophaculster.关键词：氨氧化菌(AOB)；末端限制性片段长度多态性技术(T-RFLP)；氨单加氧酶(amoA)；处理工艺中图分类号：X171.5文献标识码：A文章编号：1000-6923(2009)06-0622-07ImpactsofwastewatertreatmentprocessonAOBandbacteriacommunities.WANGXiao-hui,WENXiang-hua*,YANGNing-ning,XUMei-lan,DINGKun(DepartmentofEnvironmentalScienceandEngineering,TsinghuaUniversity,Beijing100084,China).ChinaEnvironmentalScience,2009,29(6)：622~628Abstract：CommunitiesofAOBinactivatedsludgescollectedfrom4wastewatertreatmentsystemsin2plantsinBeijingwereexaminedusingspecificPCRfollowedbyterminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism(T-RFLP),cloning,andsequencingofamoAgenes.CommunitiesofbacteriawerealsoinvestigatedbyusingT-RFLPbased16SrRNAgenes.TheT-RFLPfingerprintsanalysisshowedthatthedominantterminalrestrictionfragments(T-RFs)ofAOBwere291,354bp,andthedominantT-RFsofbacteriawere115,117,166,455,465,468,471,482,800and893bpetc.inallthese4systems.TheT-RFLPprofilesanalysismayalsoindicatetheAOBandbacteriastructureswereslightlyaffectedbythetreatmentprocess.PhylogeneticanalysisofclonedamoAgenesclearlyshowedthatthedominantAOBinthese4systemsweremembersofNitrosomonaseuropaeaclusterandNitrosomonasoligotrophacluster.Keywords：ammonia-oxidizingbacteria(AOB)；T-RFLP；amoA；treatmentprocess城市污水处理厂普遍存在脱氮过程不稳工艺对微生物群落结构影响的研究还很少.定的现象[1-2].导致问题出现的重要原因之一是本研究采用T-RFLP解析了北京某城市污水硝化细菌,特别是氨氧化菌(AOB)生长缓慢,对处理系统中AOB及细菌的群落结构,并分析了处水质和运行参数等的冲击敏感.因此,氨氧化过理工艺对微生物群落结构的影响,旨在为污水处程被认为是硝化反应的限速步骤[3].深入理解理系统的稳定运行与优化控制提供科学依据.污水处理工艺中AOB的群落结构和功能,对控1材料与方法制和提高污水处理过程中脱氮的稳定运行具有重要作用[4-5].1.1污水处理系统及采样传统的微生物培养方法很难获得微生物群活性污泥样品采集于北京市2个污水处理落结构的准确信息[6].由于末端限制性片段长厂的4个污水处理系统中,系统A1、A2和系度统多态性技术(T-RFLP)具有相对高的灵敏度和可B1、B2分别位于厂A和厂B中.这4个污水处重复性[7],已经被广泛用来解析环境中微生物的理系统的工艺不同,A2和B1为A2O工艺,A1为群落结构[8-13].已有研究者分析了不同污水处理收稿日期：2008-11-28系统中运行条件和环境参数,如水质[14]、DO[10],基金项目：“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAC19B01-02)SRT[3]等对微生物群落结构的影响.但针对处理*责任作者,教授,[e-mail]6期王晓慧等：污水处理工艺对氨氧化菌及细菌群落的影响623倒置A2O工艺,B2为AO工艺.系统A1和A2处进行T-RFLP分析时,AOB正向引物amoA-1F理对象为生活污水,系统B1和B2处理对象均为的5′端用FAM荧光素标记,PCR反应后即可得到生活污水和工业废水的混合废水.4个污水处理荧光标记的DNA片段.扩增产物用QIAquick系统的部分进出水水质及运行参数见表1.PCRPurificationKit试剂盒(Qiagen公司,德国)进行纯化.表1污水处理系统运行参数Table1Parametersofwastewatertreatmentsystems项目A1A2B1B2进水BOD(mg/L)236236156141.2进水NH4+-N(mg/L)41.041.045.943.6进水TN(mg/L)58.658.652.560.4出水BOD(mg/L)11.29.226.67.7出水NH4+-N(mg/L)2.141.150.44.1出水NO2--N(mg/L)3.731.220.20.96出水NO3--N(mg/L)9.5212.3723.47.75出水TN(mg/L)17.617.125.216.1污泥浓度(mg/L)34323209SRT(d)1313DO(mg/L)2.292.58所有活性污泥样品均采集于2007年8月,具体的采样位置为每个系统好氧区的末端,每个对于总细菌16SrDNA的扩增,选用细菌的通用引物对8F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGT2TACCTTGTTACGACTT-3′).PCR反应体系为50μL,包括1μL模板DNA,5μL缓冲液(Tris-HCl100mmol/L,KCl500mmol/L,MgCl215mmol/L),4μL脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)混合物(2.5mmol/L),正反向引物(10pmol/μL)各1μL,0.25μLTaqDNA聚合酶(5U/μL,TaKaRa,日本),35.75μL灭菌高纯水.PCR扩增程序如下:94℃预变性5min;94℃变性60s,55℃退火45s,72℃延伸45s,共25个循环;72℃延伸10min.1.4T-RFLP分析对于纯化后的AOB和总细菌PCR产物进行酶切.AOB用TaqI(TaKaRa,日本)在65℃下酶切反应6h,细菌用RsaI(NEB,英国)在37℃下反应样品1.5mL,样品采集后立即置于冰上,运至实验6h.反应体系均为20μL,包括PCR产物10μL,限制室.离心(14000×g)弃上清液后,-20℃保存.性内切酶1μL,缓冲液2μL,牛血清白蛋白1.2DNA提取(200μg/mL)2μL,灭菌高纯水为5μL.酶切之后进采用FastDNA®SpinKitforSoil试剂盒行脱盐纯化[15],荧光标记的片段再用ABI3130(Qbiogene公司,美国)提取活性污泥中的总DNA.型遗传分析仪(AppliedBiosystems,美国)进行分活性污泥样品首先用灭菌高纯水离心(14000×g)清离,内标为500LIZ.取荧光强度50RFU为基线,洗2遍后,再按照试剂盒产品说明书提取总DNA.得到的T-RFLP图谱用GeneMap(Version3.7)进1.3PCR扩增行分析.对于小于50bp的片段,舍去不进行后续对于AOB的扩增,选用针对功能基因amoA的分析.在每个T-RFLP图谱中,计算每个峰的峰面引物对amoA-1F(5′-GGGGTTTCTACTGGTG积与所有峰总面积的比率来表征每个末端限制GT-3′)和amoA-2R(5′CCCCTCKGSAAAGCCTT性片段(T-RF)的相对量.对于AOB,舍去相对数CTTC-3′;K表示G或T;S表示C或G).PCR反应量小于2%的T-RF,而对于细菌,舍去相对数量小体系为50μL,包括1μL模板DNA,5μL缓冲液于1%的T-RF.(Tris-HCl100mmol/L,KCl500mmol/L,MgCl21.5多样性指数15mmol/L),4μL脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)混多样性指数选取Shannon-Weiner指数(H),合物(2.5mmol/L),正反向引物(10pmol/μL)各其计算公式为:H=−∑PilnPi,其中Pi表示每个2μL、0.25μLTaqDNA聚合酶(5U/μL,TaKaRa,日本),35.75μL灭菌高纯水.PCR扩增程序如峰面积占总面积的比率.下:94℃预变性5min;94℃变性60s,55℃退火1.6克隆文库建立和测序90s,72℃延伸90s,共40个循环;72℃延伸10min.用非荧光标记的引物对AOB进行PCR扩增,624中国环境科学29卷扩增产物连接到pGEM-TEasy载体(Promega,美国)上,再转化到EscherichiacoliDH5αTM细胞中.通过蓝白斑筛选阳性克隆,并用T7和SP6作为引物的PCR反应检验克隆是否插入正确长度的片断.以插入正确片段的阳性克隆为模板,再用AOB的引物进行PCR反应,对PCR反应产物进行酶切电泳分析和T-RFLP分析,结合两者的结果对AOB克隆进行分类,挑取每个类型的克隆菌液进行测序(北京诺赛基因公司).1.7序列系统发育学分析获得的amoA基因序列与GenBank进行比对(),并下载相近序列.用Mega4.0软件对序列选取最小相邻法(Neiborjoining)构建系统发育树.2结果与讨论2.1T-RFLP指纹图谱4个污水处理系统AOB的T-RFLP图谱如01所示,图谱表明不同系统中AOB的优势T-RF非常相似.所有系统均含有大量的219bp及354bp片段,系统A1和A2亦含有少量的349bp及491bp片段,系统B1也含有少量的491bp片段.Siripong等[1]采用同样方法研究了美国多个污水处理系统中AOB的群落结构,结果表明系统中大量存在着219,354,491bp的T-RF.Park等[10]采用相似方法,也发现小试规模反应器的活性污泥中存在大量219,283,491bp的T-RF.荧光强度(RFU)4000A1200002003004005006007001004000A2200001002003004005006007004000B1200001002003004005006007004000B220000100200300400500600700片段长度(bp)图1不同污水处理系统AOB的T-RFLP图