荧光光谱

1荧光分光光度法一、基本原理分子发光：处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光能等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。发光分析包括荧光、磷光、化学发光、生物发光等。物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光。1.分子能级、荧光的产生分子能级=电子能级(Ee)+振动能级(Ev)+转动能级(Er)。其中电子能级包含振-转能级，如图。2基态：电子自旋配对，多重度=2s+1=1，为单重态，以S0表示。激发单重态：分子吸收能量，电子自旋仍然配对，为单重态，称为激发单重态，以S1，S2…表示激发三重态：分子吸收能量，电子自旋不再配对，为三重态，称为激发三重态，以T1，T2….表示。三重态能级低于单重态（Hund规则）32.定性分析任何荧（磷）光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱。它们是荧（磷）光定性分析的基础。1）激发光谱改变激发波长，测量在最强荧（磷）光发射波长处的强度变化，以激发波长对荧光强度作图可得到激发光谱。激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者完全相同！这是因为分子吸收光能的过程就是分子的激发过程。激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选择最适宜的激发波长。42）发射光谱发射光谱即荧光光谱。一定波长和强度的激发波长辐照荧光物质，产生不同波长的强度的荧光，以荧光强度对其波长作图可得荧光发射光谱。由于不同物质具不同的特征发射峰，因而使用荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质。如右图所示。53）激发光谱与发射光谱的关系i）波长比较与激发（或吸收）波长相比，荧光发射波长更长，即产生所谓Stokes位移。（振动弛豫失活所致）ii）形状比较荧光光谱形状与激发波长无关。尽管分子受激到可到达不同能级的激发态，但由于去活化（内转换和振动弛豫）到第一电子激发态的速率或几率很大，好像是分子受激只到达第一激发态一样。换句话说，不管激发波长如何，电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。iii）镜像对称通常荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系6荧光分析的特点：灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.1~0.001g/mL之间。可见比UV-Vis的灵敏度高得多！WHY？选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测量的因素较多。7环境对荧光参数的影响荧光分析的主要特点是灵敏度高。一般来说，荧光分析的灵敏度要比吸收光谱测量高2－3个数量级。但正因为其灵敏度高，因此也容易受到各种因素的干扰。例如样品的温度度、pH值以及样品中杂质的存在等等。有时，为了得到可靠的结果，实验设计和操作中需要考虑和设法减少这些因素的影响；有时，也可巧妙地利用荧光参数对环境困素的敏感性来达到我们的目的。下面，我们将分别列举一些环境因素对max、F和F等荧光参数的影响。8环境因素对max的影响环境(如溶剂)的极性对max的影响(一般情况下,环境极性加强，max红移.但并不是绝对的.)pH值对max的影响(如果荧光物质为弱酸或弱碱，则溶液pH值的改变常对max有影响。这是因为弱酸和弱碱分子和其离子在电子结构上有所不同，因而荧光max也可能发生变化)溶液粘度对max的影响9环境对荧光量子产率F和荧光强度的影响稀溶液中荧光强度FKI0AF（这里I0是激发光强度，A是光密度或吸收度，0是荧光量子产率，K为常数），因此凡是会影响荧光量子产率F的环境因素也必然会影响荧光强度。溶剂（或环境）极性的影响,量子产率（荧光强度）会随着溶剂（或环境）极性的减小而增加温度对荧光强度的影响,一般来说，溶液的荧光强度随温度的降低而增强浓度对荧光强度的影响.在样品浓度较低时，荧光强度与荧光物质的浓度成正比。但到了一定浓度以后，就不再存在这种正比关系.杂质对量子产率（荧光强度）的影响.pH值对量子产率和荧光强度的影响溶液粘度对荧光强度的影响10其它各种干扰因素一些其它的干扰因素可能影响荧光强度：光散射可能影响荧光强度。区分散射光和荧光发射的依据，是散射光与激发光波长相同，离荧光峰较远；荧光污染也是影响荧光强度的一种因素：洗涤器皿的合成去污剂常能产生很强的荧光；分液偏斗上涂的润滑油也有很强的荧光；溶液中微生物的产生；滤纸中的杂质；表面吸咐也会对稀溶液的荧光测定造成影响。11荧光熄灭碰撞熄灭能量转移氧的熄灭自熄灭和自吸收12荧光分光光度计基本结构光源单色器吸收池检测器13二、荧光仪器（光源与检测器处于相互垂直的位置）第一单色器或滤光片记录仪第二单色器或滤光片荧光光源激发样品池1）光源：氙灯、高压汞灯、激光；2）样品池：石英（低荧光材料）；3）两个单色器：选择激发光单色器；分离荧光单色器；4）检测器：光电倍增管。14荧光分光光度计检测器光电池光电管可见区测量、价廉耐用、响应速度慢、灵敏度低灵敏度、响应时间优于光电池灵敏度高，响应快响应速度最快。灵敏度低于光电倍增管二极管阵列检测器光电倍增管、15荧光分析的应用1、定性分析任何荧（磷）光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱。它们是荧（磷）光定性分析的基础。激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选择最适宜的激发波长。2、定量分析If=Kc该式只有在εlc＜＜0.05才成立，即荧光分析必须在极稀的溶液中才可以用于定量测定，否则校正曲线弯曲。