正交法研究光合细菌计数培养基

正交法研究光合细菌计数培养基摘要:利用正交设计试验法研究了碳源、酵母膏、微量元素、磷酸盐、铁盐、琼脂等6个因子对光合细菌培养计数的影响,确定了各因素的最佳配比,其结果是:NaHCO31.0g,CH3COONa3.0g,酵母膏2.0g,微量元素0ml/L,K2HPO40.5g,Fe-EDTA0.005g,琼脂8g。该组合加上NH4Cl1.0g,MgCl2.6H2O0.2g,NaCl5.0g,dH2O1000mL,即得出光合细菌计数培养基,称之为R培养基。该培养基对光合细菌的检测具有准确、快速、简便等优点。关键词:光合细菌;培养基;正交法1前言光合细菌(PhotosyntheticBacteria,简称PSB)是一大类能进行不产氧光合作用的细菌,由于它具有能利用有机小分子作为碳源的生理特性,且菌体本身又无毒无害、营养丰富的特点,因而在水产养殖、废水处理等行业中得到了广泛应用,并在新能源开发、种植业、食品、化妆品、医药保健等行业显示出广阔的应用前景[1,2],特别是在水产养殖方面,随着可持续发展理念的兴起,光合细菌在水产健康养殖中扮演着越来越重要的角色,并正进入了一个快速发展阶段。但是由于缺乏统一的检测方法,光合细菌的主要指标,即活菌密度一直无从准确测定,致使光合细菌制剂至今还没有国家标准,由此造成光合细菌市场鱼龙混杂,反而成为水产养殖及环境生态的一大隐患。目前,有关光合细菌的重点仍在菌种的分离、培养及其应用技术的研究,研究中对光合细菌培养量的评估,基本上是采用光电比色法或显微直接计数法。由于市售光合细菌制剂存在菌种复合、杂菌污染、培养基质干扰以及色素掺假等问题,上述两种方法显然不够准确,光合细菌的准确计数必须通过菌落计数来确定。然而目前这方面的报道还很少,仅见孙军德等人[3]作了光合细菌双层平板计数法的研究,而该报道只是针对实验室某一纯培养物的研究结果,还难以推广应用。本文采用正交法研究出光合细菌的计数培养基,即R培养基,经验证,该培养基对光合细菌的检测具有专一性和特异性,而且快速简便,在实际应用中效果良好。2材料与方法2.1试验材料光合细菌菌种:沼泽红假单胞菌(Rhodopseu-domonaspalustris)、球形红假单胞菌(Rhodopseudomonassphaeroids)、荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonascapsu-late)混合培养物,由华东师范大学环境科学研究所提供,浑球红假单胞菌RS601(Rhodopseudomonasspheroids)由中科院上海植物生理研究所提供,红球菌AB96026(Rhodococcussp.)由中国典型培养物保藏中心提供。其他菌种:桔橙色动球菌AA98005(Kineococcusaurantiacus)、桔橙小单胞菌AA95041(Micromonosporaaurantiaca)、深红酵母AY91005(Rhodotorularubra)、红酵母AY93148(Rhodotorulasp.)、金黄色葡萄球菌AB91053(Staphylococcusaureus)、大肠埃希氏杆菌AB90054(Escherichiacoli)、鼠伤寒沙门氏菌AB94007(Salmonellatyphimurium)、痢疾志贺氏菌AB200058(Shigelladysenteriae)由中国典型培养物保藏中心提供。副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)由本实验室从海水中分离并经VITEK-AMS鉴定至种。所用试剂均为分析纯。2.2方法2.2.1光合细菌培养条件的确定参照文献[3~7],选择光合细菌的培养条件为:温度28e~30e,光照强度3000Lx,培养72h,如果菌落#45#2004年检验检疫科学第14卷第1期*作者简介:刘军义(1966-),男,中科院武汉病毒研究所毕业,理学硕士,已发表论文15篇。表1试验因子水平因子水平因子种类及其代号A碳源(g)B酵母膏(g)C微量元素贮液(mL)D磷酸盐(g)E铁盐(g)F琼脂(g)一水平NaHCO32.01.03KH2PO40.50.28二水平NaHCO34.01.55K2HPO40.50.120三水平NaHCO31.0CH3COONa3.02.00.5KH2PO40.250.0255四水平NaHCO32.0丁二酸钠1.0CH3COONa2.00.10K2HPO40.3KH2PO40.50.00515五水平NaHCO32.5CH3COONa2.50.51KH2PO40.050.0510不明显,则继续培养48h。2.2.2光合细菌的菌落计数方法选用合适的连续3个菌液稀释度,接种于25mL的具塞比色管内,每个稀释度用两只试管,迅速倾注20mL已融化放冷至45?1e的培养基于管内,等冷却后再覆盖5mL1%的灭菌纯琼脂。光合细菌的典型特征是菌落呈粉红色、红色、红褐色或深红色,在培养基中菌落呈铁饼状。菌落计数参照SN0168-1992[8]的规定,计数时以25~250个菌落为合适范围,适宜稀释度的两个试管的菌落数据平均值或两个稀释度的试管菌落数平均值乘以相应稀释倍数即得到每毫升样品中的光合细菌活菌数。2.2.3光合细菌计数培养基配方的确定根据文献[9~16]提供的配方,确定光合细菌计数琼脂的基本配方包含的要素为C源、N源、磷酸盐、镁盐、铁盐、酵母膏、微量元素、氯化钠、琼脂、抗氧化剂等十大因子。其中N源固定为NH4Cl1.0g/L,镁盐固定为MgCl2.6H2O0.2g/L,氯化钠固定为5.0g/L,抗氧化剂固定为0.25g/L。其余6个因子(每升中的含量)采用正交试验法来选择。采用L25(56)正交表,按照文献方法,将因素水平随机化后,得到实际使用的因素水平表见表1。以1:107稀释度的试管菌落计数作为各序号的试验结果,以计数结果为考核指标,计数越高,则培养基效果越好。根据试验结果,确定培养基的最佳配方。试验所用菌种为沼泽红假单胞菌、球形红假单胞菌和荚膜红假单胞菌的混合培养物。微量元素(T.m.)贮液:H3BO30.7g,MnSO4.H2O389mg,Na2MoO4.2H2O188mg,ZnSO4.7H2O60mg,蒸馏水1000mL。铁盐:FeSO4.7H2O5.57g,Na2-EDTA7.45g,蒸馏水1000mL。2.2.4培养基的验证试验2.2.4.1当试验结果分析得出的理论最佳配方就是实际中出现的某一配方时,即可直接将得出本实验的最佳配方即是该配方。此时采用孙军德等人[3]的双层平板培养法作对照,比较两种方法的计数结果,验证培养基的适用性。当试验结果分析得出的理论最佳配方在试验中并未出现时,则将理论最佳配方与试验中实际出现的最佳配方以及可能出现的修正配方同时作比较,以双层平板法作对照,以作最终确定。除用试验菌种液外(标记为a),还抽取市场上3种不同来源的光合细菌水产制剂(分别标记为b、c、d)进行检测,作培养基效果验证,以培养计数最高者为优选。2.2.4.2用本文试验材料中介绍的其他光合细菌菌种和非光合细菌菌种验证培养基的专一性和特异性。看试验设计的培养基是否只有光合细菌才能生长(专一性)或是否只有光合细菌才能产生特异性的培养特征(特异性)。方法是将菌种活化后,培养24h,吸取1:10培养物,接种于设计的光合细菌培养基中,观察各自的生长情况。3结果3.1培养基最佳配方的选择试验计划表与结果分析如表2所示。从表2可以看出,培养基各因子最优的组合方案是A2B3C4D2E4F2。因子的重要次序是:EBAFCE。铁盐的极差最大,然后依次是酵母膏、碳源、琼脂浓度、微量元素和磷酸盐。理论最佳配方的#46#2004年检验检疫科学第14卷第1期表2计划表及结果分析试号A碳源B酵母膏C微量元素D磷酸盐E铁盐F琼脂菌落计数@1071111111612122222833133333744144444725155555716212345977223451648234512899245123731025123484113135245712321358313335241100174034135215352413171641425373174253145418431425801944253150204531427321515432812252154361235321546524543215312555432163k172.273.871.271.050.467.61726k281.469.062.474.271.279.2k365.481.659.871.674.459.6k466.059.276.062.880.666.4k560.261.675.865.668.672.4R21.222.416.211.430.219.6表34种可能的最优组合培养基的检测结果(72h)样品\培养基菌落计数(@107)1#2#3#4#对照a79102836825b9512810583NDc971079876NDd49544844ND平均值80988468*对照为孙军德等人[3]报导的双层平板计数法培养基。/ND0表示未检测。选择是:NaHCO34.0g,酵母膏2.0g,微量元素0g,K2HPO40.5g,Fe-EDTA0.005g,琼脂20g。该组合在表中并未出现,实际出现的最佳组合是13号组合:A3B3C5D2E4F1,各成份配比如下:NaHCO31.0g,CH3COONa3.0g,酵母膏2.0g,微量元素1mL/L,K2HPO40.5g,Fe-EDTA0.005g,琼脂8g。比较理论最佳和实际最佳组合,可以发现,二者在酵母膏、磷酸盐和铁盐的选择上完全一致,但在碳源和琼脂含量上则有明显不同,需作进一步验证。在微量元素的选择上也有所不同,不过二者的k值非常接近,为简便起见,可统一选用C4,即不添加微量元素。由此设计出如下4种可能的最优组合:1#理论最佳:A2B3C4D2E4F22#实际最佳:A3B3C5D2E4F1,将C5改选为C4后,修正为A3B3C4D2E4F13#理论最佳变化1(琼脂含量改为F1):A2B3C4D2E4F14#理论最佳变化2(碳源改为A3):A3B3C4D2E4F2。3.2培养基的验证结果3.2.1培养基效果即准确性的验证结果4种可能的最优组合培养基对4种样品的检测结果如表3所示。从表中可以看出,2#培养基对所有样品的计数均为最高,为最佳选择。因此本试验最后得出的最佳组合是A3B3C4D2E4F1,各因子的配比为:NaHCO31.0g,CH3COONa3.0g,酵母膏2.0g,微量元素0mL/L,K2HPO40.5g,Fe-EDTA0.005g,琼脂8g。培养基的最佳配方则是在此基础上,加上NH4Cl1.0g,MgCl2.6H2O0.2g,NaCl5.0g,dH2O1000mL,pH7.6?0.2。将这种培养基命名为R培养基。试验表明该培养基在48h内就可得出培养结果。3.2.2专一性和特异性验证结果沼泽红假单胞菌、球形红假单胞菌、荚膜红假单胞菌、浑球红假单胞菌RS601、红球菌在R培养基上生长良好,菌落呈粉红色、红色、红褐色或深红色等特征性颜色,非常容易识别。而桔橙色动球菌、桔橙小单胞菌、深红酵母、红酵母、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌均在R培养基中均未见形成明显的菌落。不过,在对光合细菌水产制剂进行实际检测时,发现有少量不呈色素的菌落,对这些菌落未作进一步鉴定,推测是一些异养杂菌。这些杂菌的检出,反过来也验证了R培养基的特异性。#47#2004年检验检疫科学第14卷第1期由此可见,R培养基对光合细菌的检测具有较好的专一性和很强的特异性。4讨论目前开发应用的光合细菌主要是红螺菌科的光合细菌,这类光合细菌富含类胡萝卜素,因而其培养物通常呈现褐色至红色,可以很容易地与其他微生物区别开来,这为光合细菌计数培养基的设计带来了方便。设计时,利用光合细菌能利用小分子有机物作为供氢体的生理特点,碳源以碳酸氢钠和