γH2AX：DNA双链断裂的标志

γＨ２ＡＸ：ＤＮＡ双链断裂的标志余艳柯１，陆源２，余应年１，杨军１（浙江大学医学院１．病理生理学教研室，２．机能中心，浙江杭州３１００３１）摘要：γＨ２ＡＸ是目前国内外研究细胞ＤＮＡ损伤应激反应的热点之一。细胞在电离辐射或其他因素作用下直接诱导或是通过复制压力诱导形成的双链断裂（ＤＳＢｓ），以及细胞自身调控的程序性ＤＳＢｓ和逆转录病毒转染细胞过程中产生的ＤＳＢｓ均可诱导Ｈ２ＡＸ的磷酸化（γＨ２ＡＸ）和簇集。本文对Ｈ２ＡＸ及其组蛋白家族，以及γＨ２ＡＸ与ＤＳＢｓ之间的关系及可能作为一个探测ＤＮＡ损伤的新分子探针来利用作一简要综述。关键词：γＨ２ＡＸ；ＤＮＡ损伤；诱变剂中图分类号：Ｒ３９４．６文献标识码：Ａ文章编号：１０００３００２（２００５）０３０２３７０４许多环境理化因素可导致癌症的发生，比如黄曲霉素致肝癌，胺基染料致膀胱癌，苯致白血病，吸烟致肺癌，以及电离辐射（ｉｏｎｉｚｉｎｇｒａｄｉａｔｉｏｎ，ＩＲ）致白血病等。大多数的已知环境致癌物都是遗传毒物，即它们与细胞的ＤＮＡ发生反应而诱发癌症［１］。癌症时刻威胁着人类的生活和工作。随着人口的增长和老龄化的趋势，以及环境污染的日益严重，癌症的发病率还会逐渐增加。在人类进化过程中，细胞针对各种因素造成的ＤＮＡ损伤，形成了特异性的细胞应激反应体系（ｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏｇｅｎｏｔｏｘｉｃｓｔｒｅｓｓｅｓ），以保证细胞正常的生长和有机体的存活。而当这类应激反应发生变化时，往往会导致癌症的发生。因此，更好的理解细胞对遗传损伤的应激反应，有助于人们预防乃至治疗癌症。其中及时地感应ＤＮＡ的损伤并进行修复，是至关重要的一个问题。在此研究领域中，目前所达成的共识是许多与染色体结构的维持、保护、修复相关的蛋白质有组织的按顺序在ＤＮＡ损伤位点结合形成一个焦点（ｆｏｃｉ）复合物，共同完成对ＤＮＡ损伤的检测并进行修复，并且在此过程中根据损伤程度的不同导致细胞周期停顿或细胞凋亡。在对焦点复合物的研究过程中，磷酸化的Ｈ２ＡＸ（γＨ２ＡＸ）吸引了众多研究者的目光。人们发现，细胞在受到ＤＮＡ损伤收稿日期：２００４１０２２接受日期：２００５０１２３基金项目：国家重点基础研究发展规划项目（２００２ＣＢ５１２９０１）；国家高技术发展规划项目（２００４ＡＡ６４９１２０）；国家自然科学基金资助项目（３０３００２７７）；国家自然科学基金资助项目（３０４７１９５６）作者简介：余艳柯（１９８０－），男，汉族，浙江省慈溪人，硕士研究生，研究方向为Ｈ２ＡＸ在细胞ＤＮＡ损伤应激反应中的作用。联系作者Ｅｍａｉｌ：[e-mail]／Ｆａｘ：[phone]尤其是ＤＮＡ双链断裂（ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｅｄｂｒｅａｋｓ，ＤＳＢｓ）损伤后，在ＤＳＢｓ位点会出现由γＨ２ＡＸ形成的焦点。随着对γＨ２ＡＸ研究的深入，研究者们发现，γＨ２ＡＸ对于其他蛋白募集到焦点起着非常关键的作用，因此是细胞应激反应中的重要成员。同时，由于γＨ２ＡＸ的出现与ＤＳＢｓ紧密相关，γＨ２ＡＸ也极有可能成为检测细胞ＤＮＡ损伤的一个新的特异性指标。本文将对目前γＨ２ＡＸ的新研究进展作一综述。１Ｈ２ＡＸ及其组蛋白家族真核细胞中的ＤＮＡ不是游离存在的，而是与组蛋白和非组蛋白形成复合物。在Ｈ１，Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３和Ｈ４五种组蛋白中，Ｈ１的种族保守性很低，但有组织特异性，而另外四种组蛋白具有高度的保守性。在染色质中，由１４７个碱基对的ＤＮＡ在由各两个Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３和Ｈ４分子组成的八聚体上缠绕１圈形成核小体核心。核小体核心再加上一段含有Ｈ１组蛋白的连接ＤＮＡ就构成了染色质的基本结构核小体。细胞可通过对这些组蛋白的不同修饰，如乙酰化、甲基化和磷酸化等，改变核小体的构象，从而使ＤＮＡ与其他一些ＤＮＡ相互作用蛋白结合，最终影响生物功能，如基因表达和损伤ＤＮＡ的修复［２］。目前研究发现，组蛋白Ｈ２Ａ家族中共有７个成员：Ｈ２Ａ１，Ｈ２Ａ２，Ｈ２ＡＸ，Ｈ２ＡＺ，ｍａｃｒｏＨ２ＡＸ１，ｍａｃｒｏＨ２ＡＸ２和Ｈ２ＡＢｂＤ。哺乳动物细胞中的Ｈ２Ａ蛋白主要成分为Ｈ２Ａ１和Ｈ２Ａ２，这两种蛋白质的结构、功能没有明显的差异。另外的五种Ｈ２Ａ家族成员与Ｈ２Ａ１和Ｈ２Ａ２在序列上有较大的差异，并且在细胞中的含量也较少，然而，它们在染色质代谢过程及细胞生物功能中可能发挥着更为重要的作用，例如已知ｍａｃｒｏＨ２ＡＸ１和ｍａｃｒｏＨ２ＡＸ２与Ｘ性染色体的沉默有关［３］。Ｈ２ＡＸ编码基因位于１１ｑ２３．２ｑ２３．３。在大多数哺乳动物组织和细胞中，Ｈ２ＡＸ的含量大概占总Ｈ２Ａ的２％～１０％，在低等真核生物中Ｈ２ＡＸ的含量较高，在出芽酵母中几乎可达到１００％。Ｈ２ＡＸ多肽链有１４２个氨基酸残基，比Ｈ２Ａ１多１３个残基。Ｈ２ＡＸ的Ｎ端１２０个残基与Ｈ２Ａ１的该段氨基酸序列几乎完全相同，Ｃ端的２２个残基序列与目前已知的脊椎动物Ｈ２Ａ家族其他蛋白序列没有同源性，但是与一些低等真核生物的Ｈ２Ａ蛋白的Ｃ端序列有同源性。这段同源序列在进化上高度保守，包括一个１３９位为丝氨酸残基的丝氨酸谷氨酰胺谷氨酸（ＳｅｒＧｌｎＧｌｕ，ＳＱＥ）结构域［４］。ＳＱＥ结构域中的Ｓｅｒ残基可以被磷脂酰肌醇３激酶（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ３ｋｉｎａｓｅ，ＰＩ３Ｋ）家族成员毛细血管共济失调突变基因（ａｔａｘｉａｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａｍｕｔａｔｅｄｇｅｎｅ，ＡＴＭ）、ＡＴＭ和Ｒａｄ３相关蛋白（ＡＴＭａｎｄＲａｄ３ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ，ＡＴＲ）及ＤＮＡ依赖性蛋白激酶（ＤＮＡ·７３２·中国药理学与毒理学杂志ＣｈｉｎＪＰｈａｒｍａｃｏｌＴｏｘｉｃｏｌ２００５年６月；２００５Ｊｕｎ；１９（３）：２３７－２４０１９（３）：２３７－２４０ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ＤＮＡＰＫ）等磷酸化［５］。２γＨ２ＡＸ与ＤＮＡ双链断裂Ｒｏｇａｋｏｕ等［６］于１９９８年首先发现用ＩＲ及其他引起ＤＮＡ双链断裂的药物处理细胞后，可引起ＳＱＥ结构域中的Ｓｅｒ残基的迅速磷酸化，并将磷酸化的Ｈ２ＡＸ命名为γＨ２ＡＸ。进一步的研究表明，γＨ２ＡＸ焦点的形成没有细胞特异性［７］，并且无论何种因素诱导的ＤＳＢｓ都伴随有Ｈ２ＡＸ的磷酸化和簇集。２．１直接诱导细胞ＤＳＢｓ的ＩＲ或其他遗传毒物可诱导γＨ２ＡＸ焦点的形成细胞在ＩＲ作用后，Ｈ２ＡＸ迅速磷酸化并在ＤＳＢｓ位点簇集形成焦点，这一过程可发生在几分钟之内［６］，并且γＨ２ＡＸ所形成的焦点的数量与ＩＲ造成的ＤＮＡ双链断裂数量存在一一对应关系［８］。另外，酿酒酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中的Ｈ２ＡＸ同源蛋白Ｈ２Ａ１Ｃ端的ＳＱＥ结构域突变后，表现出对可引起ＤＳＢｓ的试剂的超敏感化［９］。这表明Ｈ２ＡＸ的磷酸化对于ＤＳＢｓ的识别和修复是极其重要的。２．２诱导细胞产生复制压力，进而形成ＤＳＢｓ的羟基脲或ＵＶ照射，可诱导γＨ２ＡＸ焦点的形成将处于Ｓ期的细胞用羟基脲或ＵＶ照射处理可诱导细胞产生复制压力，造成细胞周期的停顿，引起ＤＮＡ的损伤和突变。Ｗａｒｄ等［１０］发现Ｓ期细胞用羟基脲和ＵＶ照射处理后，Ｈ２ＡＸ被磷酸化，并且与ＰＣＮＡ，ＢＲＣＡ１和５３ＢＰ１等协同定位于ＤＮＡ复制停止位点。２．３细胞自身调控的程序性ＤＳＢｓ也诱导γＨ２ＡＸ焦点的形成这些细胞自身调控的程序性ＤＳＢｓ包括细胞凋亡、生殖细胞减数分裂时的ＤＮＡ重组及哺乳动物免疫系统发育时ＤＮＡ重组过程中发生的ＤＳＢｓ。在细胞凋亡过程中，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（ｃａｓｐａｓｅｓ）被激活，降解ＤＮａｓｅ的抑制物ＩＣＡＤ从而激活ＤＮａｓｅ，ＤＮａｓｅ再将ＤＮＡ降解成片段。Ｈ２ＡＸ的磷酸化和簇集在细胞凋亡过程中是一个普遍存在的现象，并且和ＤＮＡ片段的形成紧密相连，协同发生［１１］。在生殖细胞第一次减数分裂偶线期中，同源染色体开始配对，形成联会复合体。到双线期时，两条非姐妹染色单体之间发生交叉连接而出现重组。这一重组过程是由在细线期形成的Ｓｐｏ１１依赖的ＤＳＢｓ起始的。Ｍａｈａｄｅｖａｉａｈ等［１２］发现γＨ２ＡＸ焦点在Ｓｐｏ１１诱导的ＤＳＢｓ位点形成，并随着同源染色体开始联会而消失。在哺乳动物免疫系统发育过程中，Ｔ细胞受体基因和Ｂ细胞抗体基因Ｖ（Ｄ）Ｊ（ｖａｒｉａｂｌｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙｊｏｉｎｉｎｇ，可变多样性连接）重组对于Ｔ细胞受体（Ｔｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒ）反应多样性和抗体多样性的形成是一个重要的因素。在这一重组过程中，ＲＡＧ１或者ＲＡＧ２蛋白切断免疫球蛋白编码基因和Ｔ细胞受体编码基因之间的ＤＮＡ，然后引入一段重组信号序列，随后通过非同源ＤＮＡ末端连接通路（ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓＤＮＡｅｎｄｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥＪ）进行连接和修复形成新的功能基因。Ｃｈｅｎ等［１３］发现，γＨ２ＡＸ和ＮＢＳ１可以协同定位于未发育成熟的胸腺细胞的ＲＡＧ蛋白，诱导形成的ＤＳＢｓ位点。然而Ｂａｓｓｉｎｇ等［１４］发现，Ｈ２ＡＸ缺失的ＥＳ细胞中的Ｖ（Ｄ）Ｊ重组的效率和数量都没有发生明显的变化，而ＮＨＥＪ通路中的蛋白分子如缺失则显著地削弱Ｖ（Ｄ）Ｊ重组。这些现象表明，Ｈ２ＡＸ并不是直接参与Ｖ（Ｄ）Ｊ重组，γＨ２ＡＸ焦点的形成更多可能是细胞对ＲＡＧ诱导的ＤＳＢｓ的反应，而Ｖ（Ｄ）Ｊ重组是否顺利进行并不依赖于γＨ２ＡＸ焦点是否形成。２．４病毒转染细胞过程中发生的ＤＳＢｓ也可诱导γＨ２ＡＸ焦点的形成逆转录病毒转染细胞的过程包括吸附、侵入、整合、复制、装配和裂解这几个步骤，最终形成子代病毒。逆转录病毒的整合是由整合酶催化的。在整合酶作用下，寄主细胞的ＤＮＡ被切断，形成ＤＳＢｓ，接着病毒ＤＮＡ被引入，并与其中的一条单链连接，随后的整合后修复主要由ＮＨＥＪ通路完成。Ｄａｎｉｅｌ等［１５］发现，Ｈ２ＡＸ在逆转录病毒整合位点发生磷酸化并簇集。然而进一步的研究表明，Ｈ２ＡＸ缺失的细胞系中逆转录病毒的转染效率并没有发生明显的变化，这说明Ｈ２ＡＸ的磷酸化对于病毒转染细胞并不是必须的。３不同因素诱导的ＤＳＢｓ对于γＨ２ＡＸ的不同依赖性在多种细胞正常生理和病理情况下发生的ＤＳＢｓ均诱导了γＨ２ＡＸ的形成与簇集。然而，γＨ２ＡＸ在不同情况下诱导的ＤＳＢｓ中发挥的作用是不同的。在免疫细胞的Ｖ（Ｄ）Ｊ重组和逆转录病毒转染细胞过程中，虽然诱导产生了γＨ２ＡＸ的形成，但Ｈ２ＡＸ的磷酸化对于这两个过程并不是必须的。而Ｈ２ＡＸ缺失的细胞系表现出对电离辐射的超敏感化、基因组的不稳定性和某些试剂处理后异常的细胞校正点反应［１４］。这说明γＨ２ＡＸ对于由离子辐射引起的细胞ＤＳＢｓ及由于复制压力在细胞校正点时产生的ＤＳＢｓ的识别和修复，是极其重要的。研究者们提出一个可能的模型来解释这一差异：首先，在ＤＳＢｓ形成后，Ｈ２ＡＸ立即磷酸化，随后将一些损伤修复因子引入到ＤＳＢｓ附近，促进ＤＳＢｓ的损伤修复；其次，γＨ２ＡＸ通过与这些因子相互作用将断裂的两条链连接起来［１６］，其中γＨ２ＡＸ分别起到起始和桥梁的作用。由于在Ｖ（Ｄ）Ｊ重组过程中ＲＡＧ１和ＲＡＧ２蛋白复合体可以起到连接断裂双链的作用，而在病毒ＲＮＡ整合入宿主ＤＮＡ时，整合酶可能起到相似的作用，因而在这两个过程中，γＨ２ＡＸ的作用就不是必需的。４Ｈ２ＡＸ的磷酸化是由ＰＩ３Ｋ家族成员催化Ｐａｕｌｌ等［１７］发现，用ＰＩ３Ｋ抑制剂渥曼青霉素（ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）作用细胞，然后再用ＩＲ处理后，γＨ２ＡＸ焦点的形成急剧减少，提示Ｈ２ＡＸ的磷酸化是由ＰＩ３Ｋ家族成员催化的。进一步的研究表明，在由复制压力诱导形成γＨ２ＡＸ焦点的细胞中，Ｈ２ＡＸ的磷酸化与ＡＴＲ有关，而与ＡＴＭ和ＤＮＡＰＫ无关［１０］。相反，ＩＲ处理后，细胞内Ｈ２ＡＸ的磷酸化却主要由ＡＴＭ催化，而与ＡＴＲ无关，另外ＤＮＡＰＫ起到补充作用［１８］。这说明不同环境因素诱导形成的ＤＳＢｓ可能是通过不同通路激活不·８３２·ＣｈｉｎＪＰｈａｒｍａｃｏｌＴｏｘｉｃｏｌ２００５Ｊｕｎ；１９（３）同的ＰＩ３Ｋ家族成员，随后引起Ｈ２ＡＸ的磷酸化和簇集，并募集众多ＤＮＡ损伤反应蛋白进行损伤修复。５γＨ