(临床医学)哮喘研究从基础到临床

哮喘研究－从基础到临床Scientificresearchonasthma:frombenchtobedside浙江大学附属二院呼吸科浙江大学呼吸疾病研究所沈华浩哮喘最新定义：支气管哮喘(简称哮喘)是一种以嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等多种炎症细胞参与的气道慢性炎症。这种炎症使易感者产生气道高反应性，表现为反复发作性的喘息、呼吸困难、胸闷或咳嗽等症状，常在夜间和（或）清晨发作、加剧，常伴有广泛多变的可逆性气流受限，多数患者可自行或经治疗后缓解。哮喘研究的动物模型Experimentalmodelsforasthma应用动物模型的价值建立实验动物模型的目的是更好地解释人类疾病发病过程。通过动物模型，我们可以探讨许多难以直接从临床得到的疾病发病机理。尽管各种动物模型在体现人类疾病上还存在一定的缺陷，但不可否认的是通过动物模型所得到的信息，使得我们对人类疾病过程有了更透彻清晰的认识。人类哮喘的特征气道慢性炎症：大量炎性细胞–T淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞浸润等，它们释放出LTs、PGs、PAF等炎性介质，引起微小血管渗漏、支气管黏膜水肿、腺体分泌增加、粘液栓形成等病理改变，气道高反应性（AHR）：气道对特异和非特异刺激的高反应性，如组织胺，乙酰甲胆碱。气道重建：上皮脱落、上皮下基底膜胶原沉积、平滑肌肥大增殖、粘膜水肿、杯状细胞及粘液腺增生分泌亢进，气道周血管扩张，新生血管形成。临床研究哮喘受限制一、肺组织标本获取不易，具有一定危险性。并且仅能反映疾病发展中的某一点，不能全程反映疾病过程。二、BALF的获取更需疾病允许，尤其哮喘发作时难以获取，不易将肺的结构（病理）和功能（病理生理）结合起来。三、要明确参与LAR过程的抗体类型很不容易，因为我们不可能将某个特异抗原免疫病人而使其产生相应抗体或为其输注抗原特异性抗体。四、不能冒着哮喘发作的危险来探索引起哮喘发作的抗原。研究哮喘的动物1生来具有反复发作性喘息的动物：猫、马。2抗原激发前即具有AHR的动物：狗、啮齿类动物。3仅在抗原激发后方具有可逆性气流阻塞和/或AHR的动物：兔、羊、豚鼠、大鼠、小鼠。生来具有反复发作性喘息的动物马亦存在自发性反复发作的气流阻塞。这是因为致敏状态的马经常暴露于含有真菌孢子的干草的缘故。相同点：哮喘类型与人类哮喘相似的特征职业性哮喘暴露于抗原时症状明显脱离抗原环境、症状缓解AHR可因脱离抗原而降低变应性哮喘可逆性反复发作的气流阻塞发作后可缓解具有明确的过敏原抗原激发诱导可逆性气流阻塞和气道高反应性的动物兔羊豚鼠大鼠小鼠激发抗原的选择1.Proteinantigene.g.OVA,Derp,BetV2.Housedustmite(HDM)3.Fungie.g.Aspergillusfumigatus(extractorconnidia)4.Parasitese.g.Schistosomamansoni5.Worme.g.Nippostrongylusbrasiliensis6.Chemicalcompoundse.g.toluenediisocyanate激发抗原的选择Theallergensourceshouldreflectthehumansituation:1.HDM,pollenandfungiarenaturalallergens2.inhalationisthenaturalexpositionroute3.extractsorpollenstarchgranulaarebetterthanpurifiedprotein,but,highdegreeofvariance豚鼠曾经广泛应用于哮喘研究，直到1985年才首次在豚鼠哮喘模型上描述LAR时相，之后许多学者应用豚鼠研究了LAR。Brattard（1985）•OVA+Al(OH)2致敏豚鼠(IP)，使动物机体产生OVA特异性IgE和IgG.•在麻醉状态下，气管内滴注OVA微粒抗原致敏,6小时后可诱发出LAR，48小时后消失。•该模型中，IAR时相产生的肺阻力大于24小时后的LAR。对未致敏豚鼠或产生IgG而非IgE的致敏豚鼠进行攻击均不能诱发出LARs，•组织学表现：以嗜酸粒细胞浸润为特征的局限性细支气管炎，平滑肌收缩、粘膜下水肿和气道粘液形成在激发前/后应用激素可抑制LAR时相反应，但并不能阻断炎症细胞的募集。建立豚鼠哮喘模型有多种不同的方法（抗原种类、致敏方式等）、不同的麻醉方法和肺功能测定方法；结果表示也有不同的方法（LAR出现的时间、LAR产生的次数、LAR强度）。这说明即使在同一品系动物，应用不同的方法可引起不同程度的气流阻塞。重要的是在不同的背后存在相同之处。如在三组实验中有两组证明了在引起LARs方面抗原特异性IgE比抗原特异性IgG更为重要。此外，所用实验均说明了Eos的肺内募集与LAR存在相关性。1.应用OVA主动免疫致敏或应用大鼠杂交瘤产生的抗二硝基酚IgE被动免疫致敏。2.气管内给予特异性抗原。3.24hr后，OVA致敏组BAL中多形核细胞明显高于对照组，被动免疫致敏组（IgE致敏组）应用抗原雾化攻击1－2hr后BAL中的多形核细胞明显上升，24hr恢复正常。4.对IgE致敏组进行组织病理学检查显示，攻击2h后可见肺泡和间质水肿，伴有局限性细支气管周围多形核细胞浸润，炎症在24hr后消失。另外可见间质内单核/巨噬细胞浸润。5.无论是主动免疫致敏还是被动免疫致敏大鼠，均能建立起抗原特异性IgE依赖的气道炎症。小鼠1.小鼠模型已成为研究抗原诱导的气道反应性的一个重要的模型，因为对小鼠免疫系统认识广泛全面，可以用来研究T细胞在AHR发生发展中的作用。2.小鼠不仅可用常规方法激发，也可采用其他更简易的方法。如观察静脉给予MCH致气道收缩所需浓度。小鼠3正常或抗原致敏的小鼠气道可用来研究电刺激后神经元介质的释放。如对某一品系的小鼠反复抗原暴露可使气道对神经刺激的反应增强，表现为达到50％最大收缩（ES50）所需的电刺激频率明显降低，其原因是反复抗原刺激后神经元释放Ach能力增强。小鼠最初的小动物模型之一采用了BALB/c小鼠,动物经皮给予picrylchloride致敏，后滴鼻给予同一致敏原激发，于激发后24至48小时可见支气管周围及血管周围巨噬细胞及淋巴细胞积聚，同时伴肺阻力增加，但无动态顺应性改变。小鼠A/J小鼠以绵羊血红细胞致敏激发可致AHR及明显的肺Eos炎症，而使用抗CD4单克隆抗体阻断CD4+T细胞后AHR及肺Eos炎症均被抑制，可见该模型中气道功能的改变依赖CD4＋T细胞，而Eos是该反应的效应细胞。有两种方法证实此模型存在气道功能的改变。1、采用整体体积描记法：经静脉给予浓度依次增高的MCH后发现气流传导（airwayconductance）改变，致敏组较非致敏组对MCH的反应性明显增高。2、采用体外测定法：离体气道平滑肌给予一定量的电流刺激，随着刺激频率的增加气道收缩增强，结果致敏组小鼠的ES50较非致敏小鼠明显降低，其机理可能是电流刺激后致敏小鼠气道副交感神经末梢释放ACH较非致敏小鼠多，同时伴M2毒蕈碱受体功能丧失。急性哮喘模型ProtocolSensitization(i.p.OVA)Challenge(1%OVA)1st2nd1st2nd3rdDays01424252628Analysis(AirwaysInflammation)(Lunghistology)(Th1/Th2responses)AdvantagesofanacuteallergicmousemodelSimilartohumans-Airwayhyperresponsivenss-Eosinophylia-IncreasedIgE-Gobletcellhyperplasia/metaplasia-Mucushypersecretion-MucosalEdemaAdvantagesofanacuteallergicmousemodelUsefulforbasicresearch:-RoleofeosinophilsandCD4+T-lymphocytes-Adhesionandchemotacticmoleculesandcellrecruitment-Testconventionalpharmacologicalagents-Transgenicandgene-targetedmouseBALB/c和C57BL/6J（B6）小鼠.•近年来随着分子生物学的发展，通过转基因或基因敲除技术，已培育出数十种新的小鼠品系:•IL-5转基因:IL-5+/+，如NJ1638和NJ1720）.•IL-5基因敲除（IL-5-/-）品系.•IL-4-/-品系，IFN-a-/-品系，CD4-/-、CD8-/-、T细胞-/-，Eotaxin+/+、Eotaxin-/-，IL-13-/-，等。特殊类型细胞和细胞因子基因敲小鼠抗原致敏和激发后气道炎症反应比较细胞/细胞因子气道上皮气道粘液BALAHR缺陷病理分泌亢进嗜酸性粒细胞（Mch）Bcells++++Tcells(ab,gd)————alphabeta+Tcells————gammadelta+Tcells+++/-?CD4+cells————CD8+cells++++NK-TcellsNDND+NDEosinophils+/-+/-——野生小鼠++++特殊类型细胞和细胞因子基因敲小鼠抗原致敏和激发后气道炎症反应比较细胞/细胞因子气道上皮气道粘液BALAHR缺陷病理分泌亢进嗜酸性粒细胞（Mch）(IL-5[-/-])+/-+/-----IL-4[-/-]+/-—++IL-13[-/-]+/-—++/-IFN-r[-/-]++++野生小鼠++++036122550MethacholineDose(µg/kg)EffectsofHuangqiandDXMonairwayresponsivenessinOVA-sensitizedmice.Airwayresponsivenesswasmeasuredat48hfollowinglastOVAchallenge.ATheMeandoseresponsecurvestonebulizedmethacholine(Mch).Airwayreactivity(Penh,y-axis)inresponsetoincreasingdosesofnebulizedMch(x-axis)wasassessedbywhole-bodyplethysmography.Dataareexpreddedasthemeans±SEM(n=8-10).*p0.05comparedwithsaline/salinemice.†p0.05comparedwithsaline-treatedOVAchallengedmice.00.511.522.533.544.5AirwayObstruction(Penh)SalineOVAHuangqi-I.P28DHuangqi-I.P14DHuangqi-I.T14DDXMDisadvantagesofanacuteallergicmousemodel-Noasthmaspontaneously-Nogeneticandenvironmentalfactors-Airwaysinsensitiveforhistamine-Hardlyairwayremodeling-Noeosinophilsinairwaysunderbasalconditions-Hardlyairwayremodelingandnotachronicdisease慢性哮喘模型/气道重构模型ProtocolSensitization(i.p.OVA)Challenge(1%OVA)Analysis(AirwaysInflammation)(Lunghistology)(Th1/Th2responses)Advantagesofachronicallergicmousemodel-Sustai