HIV耐药检测

HIV耐药检测江苏省CDC郭宏雄2010-4-26AntiretroviraldrugsusedinthetreatmentofHIVinfectionMulti-classCombinationProductsNucleosideReverseTranscriptaseInhibitors(NRTIs)NonnucleosideReverseTranscriptaseInhibitors(NNRTIs)ProteaseInhibitors(PIs)FusionInhibitorsEntryInhibitors-CCR5co-receptorantagonistHIVintegrasestrandtransferinhibitors我国目前常用的药物的作用靶点与机制我国目前常用的药物的作用靶点与机制我国目前常用的药物的作用靶点与机制我国目前常用的药物的作用靶点与机制药物药物作用机制作用机制核苷类逆转录酶抑制剂核苷类逆转录酶抑制剂被靶细胞的细胞酶磷酸化后，以三被靶细胞的细胞酶磷酸化后，以三磷酸的形式与天然三磷酸竞争，从磷酸的形式与天然三磷酸竞争，从而参与病毒而参与病毒DNADNA的合成，由于该的合成，由于该抑制剂经过化学修饰，将导致病毒抑制剂经过化学修饰，将导致病毒DNADNA链合成终止。链合成终止。非核苷类逆转录酶抑制剂非核苷类逆转录酶抑制剂是一组结构多样化的化合物，通过是一组结构多样化的化合物，通过非竞争性的方式结合于或者接近于非竞争性的方式结合于或者接近于病毒逆转录酶的活性位点，从而抑病毒逆转录酶的活性位点，从而抑制病毒逆转录酶的活性。制病毒逆转录酶的活性。蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂肽类似物，通过接合于病毒蛋白酶肽类似物，通过接合于病毒蛋白酶的活性位点来抑制酶的活性，使之的活性位点来抑制酶的活性，使之不能将病毒合成的多聚前体蛋白水不能将病毒合成的多聚前体蛋白水解为病毒的各种结构蛋白和酶的组解为病毒的各种结构蛋白和酶的组成部分。成部分。HIVHIVHIVHIV的耐药性的耐药性的耐药性的耐药性HIVHIVHIVHIV耐药性是指病毒通过自身的遗传变耐药性是指病毒通过自身的遗传变耐药性是指病毒通过自身的遗传变耐药性是指病毒通过自身的遗传变异异异异，，，，产生对药物的抑制作用产生对药物的抑制作用产生对药物的抑制作用产生对药物的抑制作用，，，，使药物敏感使药物敏感使药物敏感使药物敏感性降低或不敏感的现象性降低或不敏感的现象性降低或不敏感的现象性降低或不敏感的现象。。。。药物浓度药物浓度药物浓度药物浓度病毒抑制率病毒抑制率病毒抑制率病毒抑制率(%)野生型病毒野生型病毒野生型病毒野生型病毒耐药株耐药株耐药株耐药株1000IC50,WTIC50,MT50耐药倍数耐药倍数耐药倍数耐药倍数IC50=50%抑制浓度抑制浓度抑制浓度抑制浓度产生耐药性的原因病毒自身的原因环境压力病毒自身的因素病毒自身的因素病毒自身的因素病毒自身的因素—HIV-l的逆转录酶（RT）不具有DNA聚合酶的校正功能，因此，在复制过程中，病毒核酸表现出高度的错误倾向性。病毒的高速复制过程中，高频率突变在很短的时间内随时发生。每个复制周期产生一个突变点；每天产生109–1010个新病毒；病毒基因组中平均每个碱基每天突变一次。药物的选择压力药物的选择压力药物的选择压力药物的选择压力在药物选择压力下，耐药变异株完全取代药物敏感株最快能发生在14至28天内。““WildWild””typevirustypevirus(drugsusceptible)(drugsusceptible)““MutantMutant””virusvirus(drugresistant)(drugresistant)DrugPressureDrugPressureTIMETIMEViralDynamicsandDrugResistanceViralLoadViralLoad&&ReplicationRateReplicationRateViralLoadViralLoad&&ReplicationRateReplicationRateTIMETIMELowLowReplicationReplicationRateRate&&ViralLoadViralLoadLessLess““fitfit””virusvirusPressure:DrugAPressure:DrugAPressure:DrugBPressure:DrugBPressure:DrugC,....Pressure:DrugC,....(Combined)UseofActiveAntiretroviralAgents促使耐药性病毒株出现的因素促使耐药性病毒株出现的因素促使耐药性病毒株出现的因素促使耐药性病毒株出现的因素1病毒载量病毒载量耐药株出现时间耐药株出现时间300,000300,0000.10.130,00030,000113,0003,000101030030010010030301,0001,000促使耐药性病毒株出现的因素促使耐药性病毒株出现的因素促使耐药性病毒株出现的因素促使耐药性病毒株出现的因素2病毒学失败率病毒学失败率病毒学失败率病毒学失败率(%)0204060801009590-9580-9070-8070服药依从性服药依从性服药依从性服药依从性(%)82.171.466.754.621.7促使耐药性病毒株出现的因素促使耐药性病毒株出现的因素促使耐药性病毒株出现的因素促使耐药性病毒株出现的因素3药物配伍不当药物配伍不当药物配伍不当药物配伍不当—药代显著不同药物配伍药代显著不同药物配伍药代显著不同药物配伍药代显著不同药物配伍024483612时间时间时间时间(小时小时小时小时)药物浓度药物浓度药物浓度药物浓度潜在病毒复制区IC90IC50最后一次用药最后一次用药最后一次用药最后一次用药第一天第一天第一天第一天第一天第一天第一天第一天第二天第二天第二天第二天第二天第二天第二天第二天单药治疗S.Tayloretal.11thCROIAbs131促使耐药性病毒株出现的因素促使耐药性病毒株出现的因素促使耐药性病毒株出现的因素促使耐药性病毒株出现的因素3——细胞周期依赖性药物细胞周期依赖性药物细胞周期依赖性药物细胞周期依赖性药物细胞周期依赖性药物细胞周期依赖性药物细胞周期依赖性药物细胞周期依赖性药物AZT,D4T(AZT,D4T(活化期细胞活化期细胞活化期细胞活化期细胞活化期细胞活化期细胞活化期细胞活化期细胞))DDI(DDI(静止相细胞静止相细胞静止相细胞静止相细胞静止相细胞静止相细胞静止相细胞静止相细胞))蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂((活化期细胞活化期细胞活化期细胞活化期细胞活化期细胞活化期细胞活化期细胞活化期细胞))——非细胞周期依赖性药物非细胞周期依赖性药物非细胞周期依赖性药物非细胞周期依赖性药物非细胞周期依赖性药物非细胞周期依赖性药物非细胞周期依赖性药物非细胞周期依赖性药物3TC,FTC,3TC,FTC,AbacavirAbacavirTenofovirTenofovirNNRTIsNNRTIs促使耐药性病毒株出现促使耐药性病毒株出现促使耐药性病毒株出现促使耐药性病毒株出现的因素的因素的因素的因素4——胃肠道吸收不好胃肠道吸收不好胃肠道吸收不好胃肠道吸收不好：：：：呕吐呕吐呕吐呕吐，，，，腹泻腹泻腹泻腹泻；；；；胃肠道吸收不好胃肠道吸收不好胃肠道吸收不好胃肠道吸收不好：：：：呕吐呕吐呕吐呕吐，，，，腹泻腹泻腹泻腹泻；；；；——随意间歇服药随意间歇服药随意间歇服药随意间歇服药；；；；随意间歇服药随意间歇服药随意间歇服药随意间歇服药；；；；——与中药或其他药物同时服用与中药或其他药物同时服用与中药或其他药物同时服用与中药或其他药物同时服用。。。。与中药或其他药物同时服用与中药或其他药物同时服用与中药或其他药物同时服用与中药或其他药物同时服用。。。。耐药株的检测耐药株的检测耐药株的检测耐药株的检测（1）表型检测（2）基因型检测POLGAGENV132457698kbPrRTINT297na1680naMolecularTargetsofHIVTherapy99aa250-320aaHIV-1耐药检测耐药检测耐药检测耐药检测/监测靶序列监测靶序列监测靶序列监测靶序列病人血浆标本HIVRNA病毒cDNAHIVRT和PR基因片段序列测定结果解释RNA提取逆转录PCR扩增特定的解释系统基因型检测流程标本新鲜EDTA抗凝血浆，或-80℃保存，避免反复冻融。病毒RNA提取（柱法）裂解标本，灭活RNA酶加到离心柱中，RNA与硅胶膜结合洗两次，去除杂质用无RNA酶的缓冲液洗脱RNA收集RNA备用优点：操作简便、快速、得率高Nest-RT-PCR两步法PR+RTPCR扩增引物扩增引物扩增引物扩增引物:RT21:CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG(上游外引物)MAW26:TTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC(下游外引物)PRO-1:CAGAGCCAACAGCCCCACCA(上游内引物)RT20:CTGCCAGTTCTAGCTCTGCTTC(下游内引物)RT4R:CTTCTGTATATCATTGACAGTCCAGCT(下游内引物)PR序列测序引物序列测序引物序列测序引物序列测序引物:MAW-46:TCCCTCAGATCACTCTTTGGCAACGACDSPR:GGGCCATCCATTCCTGGCRT序列测序引物序列测序引物序列测序引物序列测序引物:RT-A:GTTGACTCAGATTGGTTGCACRT-B:CCTAGTATAAACAATGAGACACHXB2-89:AATCTGACTTGCCCAATTCAATTTRT-BR:GTGTCTCATTGTTTATACTAGGRT320aaRT250aaPR99aa分片段扩增分片段扩增分片段扩增分片段扩增PR和和和和RT基因所使用的引物基因所使用的引物基因所使用的引物基因所使用的引物GenomeregionPrimersSequence(5'-3')第一套引物第一套引物第一套引物第一套引物ProteaseouterGAGp1-PR-out.forTGAARGAITGYACTGARAGRCAGGCTAATPR-new-out.revAYCTIATYCCTGGTGTYTCATTRTTProteaseinnerGAGp6-PR-in.forYTCAGRCAGRCCRGARCCAACAGCPR-new-in.revCTGGTGTYTCATTRTTKRTACTAGGTRTouterRT-out-New.forTTTYAGRGARCTYAATAARAGAACTCART-out-New.revCCTCITTYTTGCATAYTTYCCTGTTRTinnerRT-in-New.forTTYTGGGARGTYCARYTAGGRATACCRT-in-New.revGGYTCTTGRTAAATTTGRTATGTCCA第二套备选引物第二套备选引物第二套备选引物第二套备选引物ProteaseouterPR-outer.forGAACTGTATCCTTTARCTTCCCTCAPR-RT-outer.revATCTAATCCCTGGTGTCTCATTGTProteaseinnerPR-inner.forCTTTARCTTCCCTCAGATCACTCTPR-RT-inner.revTCCTGAAGTCTTYATCTAAGGGAACRTouterRT-outer.forGGAAGTTCAATTAGGAATACCACART-outer.revCTCATTCTTGCATAYTTTCCTGTTRTinnerRT-inner.forAATCAGTAACAGTACTGGATGTGGGTRT-inner.revGGCTCTTGATAAATTTGATATGTCCATPaulSandstromNationalHIVandRetrovi