石蜡切片的制作过程

石蜡切片的制作目的要求：了解生物制片的基本原理和方法；了解石蜡切片制作的基本过程；学会制作石蜡切片。一、生物制片的基本原理（一）生物制片的目的与发展概况生物制片是研究生物有机体微观结构的基础方法，其目的是提供在显微镜下以适度的样品，有效地对其进行形态和功能观察研究。（二）生物制片的方法当我们研究生物体的组织或细胞时，除了某些生物体可用相差显微镜或偏光显微镜等方法达到观察目的外，其余大部分生物体，因为组织较厚，光线不易透过内部等关系而达不到观察的要求，为了达到此目的，就必须将生物体的组织切成薄切片或不切片，经过一系列处理，使光线易于透过，即可进行观察。因此，根据标本的制作方法分为切片法和非切片法两种。这些方法，各有优缺点，应该适当的配合使用，才能获得比较理想的结果。1．切片法（1）切片法的种类切片法就是利用锐利的刀具，将器官组织或幼小个体分割成许多极薄的薄片，而制成切片标本的一种方法。切片法在切成薄片以前必须设法使组织内渗透某种支持物质。使组织保持一定的硬度，然后利用切片机进行切片。根据所用支持物质的不同切片法又可分为石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法、炭蜡切片法等类型。现分述如下：ⅰ．石蜡切片法石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法，因此用得昀多，它有很多优点：比较省时间，容易操作，可切成极薄的切片（4um以下），能制作连续切片，组织块可包埋在石蜡中永久保存。缺点是只能用于较小的组织块，较大的组织块不易切好，容易破碎，组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆。制片时间太长。ⅱ．火棉胶切片法火棉胶切片法是以火棉胶为支持剂进行切片的方法。此法的优点是包埋过程中不用二甲苯及石蜡，不经高温，可避免组织收缩及变脆，适于精细材料（如脑）的切片，也引火棉胶有韧性切片不知有折卷或破裂，适宜于大块组织及多空洞的组织（脑、眼球），硬度较高的组织（骨、肌腱）。缺点：手续麻烦、费时间，切片不能切薄，起码在10um以上，不能作连续切片，因此，在生物制片技术上已经不经常采用。ⅲ．冰冻切片法冰冻切片法是利用液体二氧化碳或其它药剂（如氯乙烷）在变成气体时吸收大量的热使组织迅速结成冰块而后再进行切片的方法。目前国内外用半导体致冷调节器来代替二氧化碳的冰冻，冷冻速度更快更为方便。冰冻切片法的优点是较前两种方法简便，组织不经脱水、透明、包埋等手续即可切片，因而可节省很多时间，十分钟左右即能制成切片。常用于临床病理手术诊断，银材料不经溶媒处理就可直接进行切片，材料不受试剂的激烈刺激及温度影响，所以组织没有显著的收缩，细胞形态不致有大的改变，也引冰冻切片不需有机溶剂处理，所以能保存脂肪、类脂等成分，所以冰冻切片法常用于组织化学，尤其是神经组织，临床病理学等方面的研究。新鲜的组织或已经固定的组织，经短时间处理后即可进行切片。用任何固定及处理的材料均适合冰冻切片，但一般的经验用福尔马林固定的材料昀适合冰冻切片，而用酒精、甘油保存的材料必须充分水洗后才易于冰冻，否则不易切成完整的切片（银究竟、甘油都能妨碍冰冻）。冰冻切片的缺点：不能作连续切片，组织块不能过大，过大不易结冰，冰冻切片易于破碎，一般冰冻切片机不易薄切，其切片往往要比石蜡切片厚1～2倍，染色也不记石蜡切片清晰，观察要有一定经验。ⅳ．炭蜡切片法炭蜡切片法优点是操作时间比火棉胶和石蜡法都短，在急用场合2～3小时即可制成切片标本。组织经固定后不经酒精及二甲苯直接进入炭蜡，故组织收缩少，能和石蜡法一样薄切，并可经行连续切片，染色效果也好，又因组织或器官不经有机溶剂处理，因而可作脂肪及类脂的检查，可代替冰冻切片法制作脂类制片。缺点：对大块及坚硬易碎的组织不适宜，切片时室温不可过高，因易软化，炭蜡吸水性强，极易融化故包埋块应妥善保管。制成的连续切片也不如石蜡法的质量高。（2）切片法制作的过程（以石蜡切片法为例）采集标本―→动物―→麻醉或杀死―→割取所需组织―→固定―→冲洗―→脱水或保存―→透明―→透蜡―→包埋―→修块―→切片―→贴片机展片―→烘干―→脱蜡―→染色―→封片。２．非切片法（1）非切片法的种类非切片法就是生物体个体或组织不用经过切片机，把其制成标本的一种方法。这种方法的优点是操作方法简便快捷，能够保持生物体或组织原有的状态，人为产物少，缺点是应用范围有限。如压碎法中的标本又改变某些组织细胞结构的正常关系等缺点。ⅰ．整体封片法将某些微小的生物体，如鱼类寄生虫，原生动物，鱼胚，鲍鱼卵等；或者生物体的一部分，如动物的某一器官（鱼的鳞片、鸟的羽毛等），经过固定、染色脱水等处理而制成标本的方法。其特点可保持生物体原有的外形。ⅱ．涂片法将液体或半流动的标本在载玻片上（或盖玻片上）涂一薄层，经过一定处理而制成标本的方法。主要应用在动物的精子涂片和血涂片上。ⅲ．展片法（铺片法）一般膜状组织铺在玻片上，将其伸展之后再进行固定及染色处理而制成标本。ⅳ．磨片法对含有钙盐等矿物质成分的材料用磨石磨成薄片制成片子的方法。如脊椎动物的牙齿，软体动物的贝壳，鱼类鳃盖骨等均可用此方法制成标本。ⅴ．离散法（渍撕散法）将组织投入适当的药液中，借助化学药剂的作用，将组织之间联连部分的物质溶解是各个细胞分离而制成标本。（2）非切片法的制片步骤固定―→冲洗（遇必要时）―→整体染色―→分化与退染―→脱水―→透明―→封藏。二、实验准备工作实验用具与药品用具及药品数量切片机（带切片刀一把）1台溶蜡箱（数控）1台展片台（数控）或水浴锅1台染色缸（立式或卧式）30个酒精灯6个滴瓶（60ml）6个甘油蛋白瓶1个树胶瓶1个切片盘6个硬纸板若干单面刀片6盒培养皿（大小）6套标本瓶（30ml）6个载玻片2盒盖玻片1盒广口瓶6个烧杯6个洗瓶6个抹布6块纱布6块毛笔1支记号笔1个无水乙醇3瓶95％乙醇5瓶二甲苯3瓶盐酸1瓶苏木精1瓶伊红1瓶苦味酸1瓶甲醛1瓶冰乙酸1瓶石蜡（52～54、56～58、60～62）3盒、3盒、3盒三、石蜡切片的制作过程（一）材料与用具1．材料：鱼皮肤、性腺、肠、肝胰脏等。2．用具：溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。（二）实验内容与步骤1．取材及固定取动物体上的小块组织成为组织块。组织块的大小以不超过0.5立方厘米为宜。切去组织块时动作要轻，切忌用力牵引或挟持，以免组织内部发生变化。组织块取下后，先用先用0.85％的生理盐水漂洗以戏曲血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24小时。如果是管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。材料由动物体取下后应当迅速固定，固定的目的是尽快使固定液渗入组织内部，将组织固定，以保持其原有的结构。不同的组织应选用适当的固定液。固定液的用量与组织块体积之比一般在20：1。不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。2．冲洗固定后的组织块在进行脱水前必须用流水洗去固定液。组织块应用纱布包好，注名，放金属水洗网中用流水冲洗，甲醛固定液固定的组织一般水洗24小时，Bouins固定液固定的组织水洗24小时。AFA固定液则不需要水洗。3．脱水和硬化经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。常用的脱水剂是不同浓度的酒精，因为酒精与水有很大的亲和力，酒精浓度可以逐渐升高，置换出组织中的水。脱水必须充分，脱水不充分会影响透明和浸蜡。脱水过程要逐级上升，不能操之过急，跳级脱水会引起组织块强烈的收缩变形。脱水所用的酒精浓度及过程如下：30％—→50％—→70％—→80％—→90％—→95％—→100％(Ⅰ)—→100％(Ⅱ)组织块在各级较低浓酒精（小于70％）中脱水的时间应视组织块的大小而定，大小不超过0.5立方厘米的组织块脱水时间为6～12小时，在高浓度酒精中（大于70％）脱水时间为3小时左右。组织块在无水酒精中需经过两次处理，以保证脱净水分。由于无水酒精有使组织变脆的缺点，故在无水酒精中脱水的时间不宜过长，一般应在15～30分钟左右。在脱水瓶中酒精的量与组织块之比约为50：1。简化步骤如下：70%（一夜）——80%（1小时）——90%（30分）——95%（30分）——100%（15分）——酒精+二甲苯（15分）——二甲苯（3分）——石蜡+二甲苯（30分）——石蜡（80分）4．透明透明是石蜡切片法切片前必经的一步。其目的在于用矿物油或植物油等透明剂置换出无水酒精，以便于熔化的石蜡浸渗到组织间隙中，故透明剂必须是能分别与石蜡和酒精相溶的。经过透明剂处理的组织块用肉眼对光观察呈透明现象，所以这个过程称为透明。常用的透明剂有二甲苯、苯、甲苯等，这些都是穿透力强易使组织变脆的透明剂，因此透明的时间宜短，一般在20分钟即可。透明时组织块由无水酒精中取出，先放入二甲苯和无水酒精等量混合的溶剂中1小时左右，然后取出放入纯二甲苯中20分钟即可。5．浸渗浸渗过程是使包埋组织用的物质深入到所有的组织间隙中，然后再通过各种方法使这种物质凝固，而将组织材料包埋其中。石蜡切片法和火棉胶切片法都需要浸渗过程。石蜡切片法是将加热的石蜡渗到组织中而火棉胶切片法是使火棉胶渗到组织间隙中去。在浸渗前要先将选好的石蜡分别以容器装好放在恒温箱中，使其杂质沉淀。石蜡昀好选用软蜡和硬蜡两种，软蜡熔点为45～50℃之间，硬蜡熔点为56～58℃之间，60～62℃的硬蜡很少用。冬天室温较低时多用软蜡，夏天室温较高时多用硬蜡。浸渗应在自动恒温箱中进行。组织块在各个蜡杯中浸蜡的时间如下：软蜡130min软蜡230min硬蜡130～60min硬蜡260～120min这一时间不是固定不变的，应视组织块的种类及大小而相应延长或缩短浸蜡时间。浸蜡的总时间一般为：0.5立方厘米的组织块时间为6～8小时；0.2～0.3立方厘米的组织块时间为3～5小时；0.1～0.2立方厘米的组织块时间为2～3小时。当发现蜡杯中有灰尘或组织碎块时应使其沉淀或过滤后再使用。浸蜡不透包埋后会出现白色不透明部分，此时需要在浸蜡一次。6．包埋包埋就是将已经浸渗好的组织块包埋于浸渗剂中，石蜡包埋法如下。浸蜡终了时，将预先预热好的和第四杯石蜡相同熔点的石蜡倒入折好的蜡槽内，然后从第四个蜡杯中取出组织块，放入蜡槽内，摆好位置，注意组织切面的摆放方向。放好组织后可以自然冷却，也可以放入冷水中直接冷却。7．塑型和切片取已经包埋好的蜡块，将纸盒拆下，用加热的刀片或解剖刀将其分成若干块（每块组织占一块），用解剖刀将组织块周围多余的石蜡切去，注意不要切到组织。把有组织的蜡块修成正方形或梯形。在进行塑型时一定要注意组织块切面的方向。蜡块塑好后将其粘在小木块上。注意要粘牢。昀后在木块侧面用铅笔记上组织块名称、编号。切片时采用手摇连续切片机。使用切片机进行切片时，将蜡块固定在切片机上，调好距离和所要求的切片厚度，然后用右手摇动手柄，即可进行切片了。一般来讲生物切片的厚度在5～10微米。对于切下的切片不要用手去取，因为体温可以使蜡片粘到手上，正确的做法是用毛笔或牙签挑取，然后放在载玻片上进行展片和粘片。8．展片和粘片切下的组织蜡片往往带有皱褶，所以在染色前必须进行蜡片的展片和粘片，即把切好的蜡片平整的粘在载玻片上。展片的温度因石蜡熔点的不同而的不同，一般的56～58℃的石蜡切片℃的温水进行展片，48～52℃的石蜡切片用35℃的温水进行展片。等到蜡片充分展平后，取一清洁载玻片，载玻片上涂一薄层蛋白甘油，然后在水中捞取蜡片，捞完后将蜡片摆正，放到格盘内，置38℃温箱中烘干，然后即可进行染色。展片和粘片比较简单容易做，但是如果处理不好则无法进行染色，即使能染上色，组织切片内部的结构也往往被破坏。9．染色和封固为了观察组织内部的细微结构，必须应用某些与固定后的原生质有亲合性的染料，对组织进行染色，否则有碍观察。普通的染色法有两种即苏木紫伊红