谷氨酸生产菌代谢机理及研究现状

题目谷氨酸生产菌的代谢机理和研究现状谷氨酸(Glutamicacid)，是人体非必须氨基酸。里索逊于1856年发现谷氨酸，至今已成为世界上氨基酸产量最大的品种。其用途非常广泛，尤其是其下游产品的开发应用。食品行业主要用于味精，增鲜剂的生产，还可与其他氨基酸并用增强功能；医药行业，多用于预防和治疗肝性昏迷，保护肝脏，是肝病患者的辅助药物。而谷氨酸在改善儿童智力发育，维持大脑机能，治疗脑震荡或神经损伤等都有一定疗效；在日常用品中，洗发水、生发剂、香皂、牙膏、香波、泡沫浴液、洗洁净等都可以见到谷氨酸的踪影；农业，谷氨酸还可以用于柑桔增甜剂、微肥的载体、杀菌剂（氨基酸铜）。1谷氨酸发酵生产及现状谷氨酸是第一个成功用于发酵生产的氨基酸。氨基酸的制取始于1820年，而直到1866年德国化学家里豪森才从小麦面筋里水解物里提取到一种碱性氨基酸-谷氨酸。1957年，日本率先用微生物发酵法生产谷氨酸，从而结束了由水解或化学合成法而制取谷氨酸的时代[1]。利用发酵法生产，有原料成本低，反应条件温和，可大规模生产等优点，是目前氨基酸生产的主要方法。我国虽然发酵法生产谷氨酸稍晚，但现已成为世界产量和消费最大的国家。以味精生产为例，其主要生产流程如下：目前，我国的味精相关产品发展迅速，产量高居世界首位。据调查，2000-2006年味精行业平均每年增长17%。我国味精年需求量为119万t，味精年人均占有量为769g，而台湾和港澳地区人均占有量为2500g，两者相差甚远。农村味精市场发展较快，各类小食品、食品加工业冷藏盐渍食品和方便食品等不断增加，味精出口逐年扩大，销路日旺。据调查预测，未来10年，中国味精相关产品产量将达到160万t。味精市场空间较大，很有发展前景。2谷氨酸生产菌发酵机理2.1谷氨酸生物合成途径谷氨酸代谢途径包括糖酵解途径(EMP)、磷酸己糖途径(HMP)、三羧酸循环(TCA循环)、乙醛酸循环、伍德-沃克曼反应(CO2固定反应)等。葡萄糖经糖EMP（主要）和HMP途径，其中一部分生成丙酮酸，再被氧化成乙酰辅酶A（乙酰CoA），然后进入三羧酸循环生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及NH4+的存在条件下，经还原氨基化反应生成谷氨酸；另一部分固定CO2生成草酰乙酸或苹果酸，草酰乙酸与乙酰CoA在柠檬酸合成酶催化下，所合成的柠檬酸，再经过氧化还原共扼的氨基化反应生成谷氨酸[2]。微生物在生长之后，理想的发酵按如下反应进行:C6H12O6+NH3+1.5O2──C5H9O4N+CO2+3H2O理论收率为81.7%，四碳二羧酸是100%通过CO2固定反应供给。若通过乙醛酸循环供给四碳二羧酸，则理论收率仅为54.4%，而实际收率处于中间值。2.2谷氨酸代谢机理自发现谷氨酸到大规模发酵生产，虽已有时日，但起生物合成途径中有一些机理尚不明确，有待研究。在生物代谢途径中，谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，其生物合成受其自身的反馈抑制和反阻遏，代谢转向合成天冬氨酸。天冬氨酸合成过量时，可反馈抑制磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧化成草酰乙酸途径中的PC酶活力，则代谢又转向谷氨酸的合成。所以正常生理条件下，微生物并不积累谷氨酸。谷氨酸合成途径中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是催化CO2固定的关键酶，受谷氨酸的反馈抑制。而柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，除受能荷调节外，还受谷氨酸的反馈阻遏。同时谷氨酸脱氢酶受谷氨酸的反馈抑制和阻遏。而乙醛酸循环在谷氨酸生物合成中的作用机理少见报道。现有研究显示，在添加生物素亚适量时，菌体细胞更加需要乙醛酸循环的回补功能[3]。生物素的影响：生物素主要通过作用于生物合成途径和细胞膜通透性两方面来影响谷氨酸合成。生物素是乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸的生物合成，继而可以影响磷脂的合成。当生物素控制在亚适量时，脂肪酸合成的不完全使磷脂合成也不完全。由于细胞膜是磷脂双分子层组成的，当磷脂含量减少到正常量的一半时，细胞发生变形，谷氨酸就从胞内渗出，在发酵液中积累。当生物素过量时，由于细胞内有大量的磷脂质，使细胞壁、细胞膜增厚，从而不利于谷氨酸的分泌，使细胞内谷氨酸大量积累，由于其自身反馈阻遏作用使谷氨酸合成量下降，造成产酸率下降，影响发酵生产的经济效益[4]。另一方面，在限量生物素时，异柠檬酸裂解酶几乎没有活力，琥珀酸氧化能力弱，苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞。同时由于完全氧化降低的结果，使ATP的形成减少，蛋白质合成活动停滞。在铵离子适量条件下，开始生成并积累谷氨酸，且生成的谷氨酸也不会通过转氨作用生成其他氨基酸。在生物素充足条件下，异柠檬酸裂解酶活力、琥珀酸氧化力、丙酮酸氧化力、蛋白质合成、乙醛酸循环比例、草酰乙酸和苹果酸脱羧反应都不断加大，导致谷氨酸合成量减少，通过转氨作用生成的其他氨基酸量也同时增加。NH4+为谷氨酸合成提供氮源，并且还可以抑制Glu生成的逆反应。当有NH4+存在时，葡萄糖的消耗速度很快，Glu的生成很高；但是当生物素充足时，NH4+几乎不影响糖代谢。有研究表明稀土元素氯化亚铈对谷氨酸棒杆菌S9114的生长及形态有一定影响。结果显示，生长前期，低浓度氯化亚铈对谷氯酸棒杆菌S9114的生长有轻微的促进作用，菌落和细胞大小略有增加；而随着处理浓度的提高和时间的延长，菌体的生长繁殖受到抑制[5]。近期有报道显示，琥珀酸对异柠檬酸裂解酶的活性具有一定的抑制作用。琥珀酸的增加对谷氨酸的合成有促进作用，而添加苹果酸则降低了谷氨酸的产量[6]。而又有研究表明，添加适量苹果酸能使关键节点发生代谢流迁移，提高了L-谷氨酸合成中心代谢途径的代谢流量[7]。3谷氨酸生产菌为在生产中大量积累谷氨酸，除了通过原料的选择，增强设备性能，发酵过程中各参数的控制，以及引进发酵产品提取的先进技术以外，对于谷氨酸高产菌的选育也是目前为提高谷氨酸产量的研究热点。3.1谷氨酸高产菌模型特征能大量积累谷氨酸的菌种应具有以下模型特征：α-酮戊二酸脱氢酶活力活力丧失或很微弱，使α-酮戊二酸不能继续氧化，继而大量氨基化合成谷氨酸。伍德-沃克曼反应能力强，使四碳二羧酸全部由CO2固定反应提供，而不走乙醛酸循环，使循环更加经济。谷氨酸脱氢酶的活力很强，并丧失谷氨酸对谷氨酸脱氢酶的反抑制和反馈阻遏。NADPH2再氧化能力弱，可使α-酮戊二酸到琥珀酸的过程受阻。NH4+充足，α-酮戊二酸经氧化还原共轭氨基化反应而生成谷氨酸却不形成蛋白质，从而分泌泄漏于菌体外。谷氨酸生产菌应不利用体外的谷氨酸，使谷氨酸成为最终产物。3.2谷氨酸生产菌育种现状继日本首先采用谷氨酸棒杆菌生产谷氨酸之后，各国开始纷纷效仿。我国最初由上海天厨味精厂采用谷氨酸棒杆菌617进行发酵生产谷氨酸。谷氨酸生产菌育种大致可分为两个阶段：60-70年代初期大规模筛选阶段，从自然界筛选出了一批谷氨酸高产菌，如AS1.299，AS1.542，天津短杆菌T6-10，钝齿棒杆菌以及棒杆菌S941等；遗传育种阶段，70年代后，将野生谷氨酸生产菌进行有目的的改造，选育出了许多优于出发菌的优良高产菌株。如WTH-1,FM84-415，CMTC6282等。过去我国谷氨酸生产菌主要有天津短杆菌，钝齿棒杆菌，北京棒杆菌及它们的突变株。目前厂家用葡萄糖发酵谷氨酸所使用的菌种主要为天津短杆菌T613的突变株，有FM820，FM84—4l5，FM一1至UFM一20，S9114等。目前谷氨酸棒杆菌S9114和FM415是我国目前用于生产谷氨酸最广泛的菌种。这些生产菌种主要是通过以诱变为主的微生物育种而获得。随着谷氨酸发酵生产的发展这些菌种的产酸能力获得了很大的提高。但如果在现有产酸能力情况下，继续采用经典微生物育种技术(如诱变、细胞融合等手段)选育菌种，以期达到大幅度提高产酸率和糖酸转化率已相当困难。随着分子生物学的发展，我们现在可以利用基因工程技术等先进技术手段从分子水平上对出发菌株进行定向改造。国外通过对野生型谷氨酸棒杆菌中丙酮酸羧化酶基因重组菌研究显示，与野生型谷氨酸棒杆菌相比，基因重组菌可以使谷氨酸产量提高7倍。目前通过从分子水平改造谷氨酸生产菌已经取得了一定进展。构建谷氨酸生产菌的基因工程菌，一般都是在已有菌株的基础上。因为已有菌株已经研究多年，其代谢机理及性状特征都比较明确，而且产酸量已经很高，那么在此基础上进行基因改造就相对比较容易和明确了。在棒杆菌上进行基因重组，需要有能够表达外源基因的载体质粒，然而目前国内外还没有找到棒杆菌本身可以作为载体的内源性质粒。因此，首先需要构建一个大肠杆菌质粒，并与棒杆菌的一些内源基因整合，而且要适合在棒杆菌内表达的穿梭质粒是目前成功构造基因工程菌的关键[8]。然而目前还处于研究阶段，取得的成果并不多。现在大多是为构建载体做准备工作，如有研究获得谷氨酸棒杆菌10147基因组中具有启动子活性片段的结构序列[9]。在研究谷氨酸代谢机理时，人们发现磷酸解酮酶(PKT)能节约由丙酮酸到乙酰辅酶A浪费的一分子CO2，从而使糖酸转化率理论值从81.7％提高到98％。国外有报道显示，利用基因工程技术将PKT的表达基因重组到棒杆菌中，能将生产谷氨酸时的糖酸转化率从60％提高到69％。相关的,也有研究以谷氨酸棒杆菌标准菌株ATCC13032染色体为模板扩增高丝氨酸脱氢酶编码基因(hom)，并在hom基因内部插入一段来源于质粒pET28a的卡那霉素抗性基因(Km)，进一步得到高丝氨酸脱氢酶缺陷的重组菌。发酵结果表明重组菌发酵60h后产酸量提高了6.7倍[10]。现在构建的质粒载体还都属于外源性的，在质粒启动复制、转录调控和产物表达方面效率不高。现阶段，我国对于谷氨酸基因工程菌的育种还属于起步和准备阶段，相比国外还是有一定差距的。