小鼠BMDM提取及培养(L929上清诱导)

Isolationofmurinebonemarrow-derivedmacrophage20180205GJH•背景介绍•L929培养•BMDM提取、诱导与培养•问题解决HematopoiesisWikipediaYolkSac(卵黄囊)FetalLiverVirginieTrouplin,etal.JOVE,2013.L929培养•Organism:Musmusculus,mouse•Morphology:fibroblast•Medium:completeDMEM(10%FBS)•Subculturing:2XTE,1minL929培养•100mmdish,10million•ten150mmdish,25mLCD/dish•4d,harvestsupernatant你需要提前准备：a)剪刀，镊子，酒精灯，打火机;b)40μm孔径滤网，15mL离心管，petridish;c)干净70%酒精，1XPBS，completeDMEM(CD)，L929上清（预热）,红细胞裂解液;d)小鼠：BALB/corC57B/6,6-12w；e)新的枪头，紫外照台面15-30min;f)泡沫板，1.5mLEP管（已灭菌），kimtech无尘纸、冰；细胞间实验室实验流程确定基因型，提前半小时准备台面ACO2处死小鼠，取两整根腿骨B剪碎腿骨，吹打冲出BMcellC均分入petridish,L929上清诱导培养D每天观察，4d密度合适分盘，持续加L929培养E7d分化成熟，富集细胞进行实验FIsolation-实验室1.二氧化碳窒息法处死小鼠；2.看脚趾编号，用针头将小鼠四肢固定在泡沫板上，腹部朝上；3.75%酒精喷湿小鼠体表，镊子理顺皮毛，剪刀剪掉一小块腹部皮肤，从切口处顺着两后肢将皮肤剪开，露出整根腿；4.顺着肌肉生长的方向剥离整根腿骨（femur,tibia/fibula,注意骨头两端不可剪破），用kimtech无尘纸包裹着撕干净残余肌肉，将干净的腿骨放到标记好的EP管，置于冰上，拿到细胞间；Isolation-细胞间1.换手套，取一个petridish，用酒精灯火焰烧好剪刀镊子置于盘盖；2.取出骨头，70%酒精浸泡30s，1XPBS冲洗3次，镊子夹取骨头置于盘底；3.1mLCD浸泡，小心剪碎骨头（注意力道，别崩出去），枪吹打出骨髓细胞（量程不可调太大，要防止倒吸），过40μm滤网到15mL离心管；4.重复步骤7两到三次，直至骨头发白；5.离心，1600rpm,4℃,3min;6.弃上清，1mL红细胞裂解液吹吸重悬，常温裂解5min;7.3X1mLCD中和，重复步骤5；8.弃上清，用CD（含30%L929上清，新鲜配制）重悬，得到大约50-100million细胞（有个体差异），均分到2-3个petridish,加5-7mL培养基晃匀，37℃，5%CO2培养.Culture过夜培养后......第一天，开始贴壁，补液5mL;第二天，继续贴壁，半换液；第三天，若绝大部分贴壁完成，全换液；否则70%换液；第四天，观察密度合适，消化分盘；第五、六天，全换液；第七天，消化，得到大约8-10million细胞（现阶段），分盘进行实验。mstfoxoWTBMDMPurityTestCD11bF4/8020171018••染菌•纤维细胞污染•诱导不成功，细胞状态差•难消化L929延伸——•BMDC•BMneutrophil•PC