RNA-基本操作技术

RNA基本操作技术（TechniquesforRNAManipulation）一、总RNA的提取二、mRNA的纯化三、cDNA的合成四、cDNA文库的构建五、文库的筛选引言RNA存在于从简单的病毒到哺乳动物细胞的所有的生命形式之中。应用RNA对细胞和分子生物学的各个方面进行研究非常普遍。由于当前没有一种方法能够直接扩增RNA，为了研究RNA所包含的功能信息，一般将其反转录成稳定的DNA双螺旋（ComplementaryDNA，cDNA)，再插入到可以自我复制的载体中。由于cDNA来自RNA，几乎不含冗余序列，通过特异性探针筛选cDNA文库，可以较快的分离到相关基因。一、总RNA的提取细胞中的总RNA包括信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)以及一些非编码的小RNA。一个典型的动物细胞约含有10-5μgRNA，其中rRNA占80%~85%，tRNA和非编码小RNA占15%~20%，mRNA占1%~5%。按照提取试剂的种类来分，可分为：异硫氰酸胍法、盐酸胍法、异硫氰酸胍-苯酚法。Trizol试剂是使用最广泛的抽提RNA专用试剂。主要由异硫氰酸胍和苯酚组成，可以迅速破坏细结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并使蛋白质与RNA分子分离，还能保证RNA的完整性。常用的RNA提取方法1、常用提取方法的种类1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟4、弃去上清液，按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃由于RNA酶存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏，固此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要。对于制备mRNA来说这些预防措施尤其重要。2、注意事项纯的RNA样品其OD260／OD280应介于1.8-2.0之间。1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚的污染；2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；OD260值=1，相当于单链DNA或RNA为40μg/mL，寡核苷酸为20μg/mL。RNA的纯度、浓度与完整性1、RNA的纯度2、RNA的浓度rRNA大小完整，而且28SrRNA和18SrRNA亮度接近2：1；mRNA分布均匀，则认为RNA质量较好。3、RNA的完整性二、mRNA的纯化绝大多数真核生物细胞mRNA的3′端存在聚腺苷酸组成的Poly（A+）尾，这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志。寡聚（dT）-纤维素柱层析法免疫磁珠法mRNA的纯化方法寡聚（dT）-纤维素柱层析法利用mRNA3′端含有Poly（A+）尾巴的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。原理寡聚（dT）-纤维素柱层析法用纤维素柱纯化具poly(A)尾-mRNA的流程示意图免疫磁珠法原理