白血病发生的分子机理和分子诊断

白血病发生分子机理和分子诊断苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所陈子兴白血病的病因学◆患者的内因:家族遗传性缺陷所致的易感性.基因组的不稳定性,单核苷酸多态性(SNP),涉及多种与保持基因组DNA稳定性和修复功能相关的基因,如TP53,ATM,FACC和第21染色体上AML1等.妊娠或出生时母体的病毒感染等.◆患者的外因(职业环境,生活方式):物理因素:光,电磁波,放射线电离辐射化学因素:来自大气和水源污染的化学物质,食品,氧自由基,化疗药物,职业和环境接触的化学物质,苯,杀虫剂,除草剂生物因素:病毒感染,逆转录病毒.造血系统的发育和形成白血病细胞的生物学特征◆无限增殖的潜能◆不同程度的分化阻滞或分化紊乱◆凋亡机制缺陷所致的细胞永生化◆向远处迁移及向周围组织侵袭◆具有克隆性起源(造血系统的级层关系明确)现代生命科学的大量实验结果表明白血病发生的根本原因是造血干/祖细胞内部遗传物质(基因和各种蛋白质)的结构和功能的异常改变.因此,与其他恶性肿瘤一样,白血病是一种”分子病”.白血病细胞深层次的异常改变可以是细胞自身内部失常所致,也可由外部环境对细胞的作用所致.白血病细胞的克隆性来源◆克隆性的定义（细胞群体的起始和来源）单克隆，寡克隆，多克隆◆分析和判定克隆性的标志异常染色体，女性X染色体连锁的G6PD基因越来越多的分子标记（单个基因，表达谱，基因组）◆分析和判定克隆性的意义和用途了解恶性造血细胞克隆的起源追踪恶性细胞克隆的演变（了解恶性克隆与正常造血细胞克隆之间的增减消长变化，化疗对恶性克隆的影响，MRD监测，HSCT后的造血重建和复发的监测。白血病干细胞的概念和识别◆白血病干细胞(LSC)的概念和证明白血病细胞群体中增殖潜能不同.将AML患者骨髓细胞中的CD34+CD38+和CD34+CD38-两个群体细胞注入NOD/SCID小鼠体内，经4-8周后以CD45+为标志从受鼠骨髓中分离出植活的人类AML细胞，均为CD34+CD38-细胞。并能在下一代受鼠二次植活.显示能将白血病细胞转入NOD/SCID受鼠体内的细胞仅存于CD34+CD38-细胞群体内。这些细胞在受鼠体内能诱发出除M3以外的各种亚型的白血病。表明其中存在具有长期自我更新能力的LSC(实验中称SCIDleukemia-initiatingcell,SL-IC)。◆白血病干细胞的免疫表型识别CD34+CD38-CD71-HLA-DR-CD90-CD117-CD123+其中CD90-CD117-CD123+是LSC的特异性免疫表型。最近新增CD47+CD96+.LSCs处在细胞周期的静止期,对化疗药物阻抗,具有独特的基因表达谱.白血病干细胞的演变过程DissecttheLSCandTransformingEventsinAML/CMLCMLv.sAMLsBCR-ABLBcl2JunB增殖生存-catenin重获自我更新能力MOZ-TIF2MLL-ENL增进或重获自我更新能力NormalCML-CPCML-BCAML仍能终末分化分化阻滞分化阻滞MyeloidBCR-ABLBcl2JunB增殖生存AML1-ETOPML-RARFlt3mutationPassegueEetal.P.N.A.S.2003;100suppl:11842-11849造血系统分化的转录调控正常和恶性淋巴系统生成中的转录调控Leukemia2009;23:1209肿瘤/白血病细胞克隆的起始和演变Nature2009;458:719AML基因组的克隆演变HSC向临床显著白血病克隆性进展的模式克隆性AML细胞群体内部存在异质性的模式AML克隆性复发的模式JanM&MajetiR.Oncogene2012;1-6白血病细胞的内在改变(分子事件)◆遗传学改变:由白血病细胞染色体非随机改变所显示的遗传物质(基因)的结构,位置异常,导致基因产物(蛋白质)的功能异常(基因融合,基因重排,基因倒位等).正常染色体核型的白血病细胞内基因的数量,结构改变(一定频率)导致基因产物(蛋白质)的数量和质量异常.(基因突变,全基因组中拷贝数改变,SNP).白血病细胞内信号通路分子和网络的改变.DNA损伤修复机制的改变导致基因组的不稳定性增高.白血病细胞的内在改变(分子事件)◆表观遗传学改变:基因启动子CpG岛甲基化态势的异常染色质的修饰和重塑动力学异常微小RNA表达谱及其靶向功能的异常再现性染色体异常所致AML的分子机理AML中几种经典融合基因产物的作用机理HoemmeCetal.Blood2008;111:2887.正常核型AML基因突变的分子机理异质性Blood2010;115:453Canercell2012;22:698Canercell2012;22:698肿瘤/白血病基因组●肿瘤/白血病细胞内的诸多体细胞突变代表着患者生命中积累突变的历史记录。●肿瘤/白血病细胞基因组内突变的“驱动突变”(Drivermutation)赋予细胞生长优势，其余突变为“过客突变”(passengermutation).基因工程分析正常细胞至少获得5-6个驱动突变才能转变成肿瘤细胞。Nature2009;458:719AML细胞中各基因突变之间的复杂关系PatelJPetal.NEngJ2012:366:1079-89白血病细胞中的信号通路异常◆信号分子和信号通路的概念◆磷酸激酶及信号通路的活化(磷酸酪氨酸激酶,PTK)◆主要的几种细胞内的信号通路及其功能Ras/Raf/MEK/ERK,JAK/STAT,PI3k/Akt/mTOR/NF-kappaB,Wnt/beta-catenin,PTEN/SHIP,细胞凋亡信号通路,Notch信号通路主要介导细胞内部中枢对外界刺激的反应,为细胞的生理存活,代谢,增殖,分化,凋亡,黏附和与外界的相互作用等提供能量.例如各种细胞因子与细胞表面的受体结合,激活受体胞膜内信号传递亚单位,募集更多胞质内蛋白质,以JAK家族分子的PTK活性通过STAT将信号传递致细胞核内.这些信号通路的失调控,可导致细胞的寿命,细胞分裂和凋亡的紊乱.如Bcr-Abl具有超强PTK活性,抑制细胞凋亡.正常HSCandAMLLSC与龛位之间的相互作用正常HSC和AML的LSC与龛位(niche)之间的相互作用。造血微环境龛位与LSC之间相互作用的调控因子对龛位与LSC的相互作用的靶向治疗KanoplaevaMY&JordenCT.JCO2011;29:591-599Nature2010;464:852-857Progenitorcellswithintheosteolineagehavekeyroleinregulationofhematopoiesisthatstretchesbeyondstemcellsupport.Perturbationinthesecellscaninducecomplexhemato-logicaldisorders,withkeycharacteristicsofMDSPrimarychangesinmicro-environmentcaninitiatesecondaryneoplasticdiseaseinheterogeneouscelltypes.OCDisDicer1deletion龛位异常诱导恶性造血的新概念白血病发病的总体分子机理◆白血病的发生和发展是一个多阶段，多步骤的连续过程。整个过程长短不一，大致可以分成起始，积累，进展和临床爆发等阶段。◆这一发病过程中发生的“分子事件”，包括细胞的遗传学异常改变，表观遗传学改变和细胞外部环境的作用。这些分子机理之间可能相互作用，也可能协同作用，交叉作用或序贯作用。某些分子机理贯穿于白血病发生发展的全过程，也可能主要在某一阶段起作用。◆基因组SNP,基因突变，基因组不稳定性和印记基因单亲二倍体(UPD)所致的单倍体功能不足为特定家族和人群提供白血病易感性的遗传背景。◆造血环境改变的压力诱导HSC发生微小和可逆的表观遗传学改变使HSC的基因表达谱发生变化，可能是白血病的启动因素。白血病发病的总体分子机理◆起始阶段HSC内的改变经过时间的积累而固化，细胞生物学表型发生变化而形成HSC的克隆性异常。在此基础上进一步发生遗传性异常改变，使异常克隆获得生长优势而持续扩增，进入进展阶段，最后达到白血病细胞克隆的临床爆发。◆遗传性改变主要从两方面发挥作用：融合基因蛋白和其他转录因子基因的突变等使造血细胞增殖，分化，衰老的转录调控发生紊乱，使造血细胞分化阻滞。具有酪氨酸激酶活性的许多信号通路分子的基因突变使许多信号通路异常激活或失活，使异常造血细胞克隆获得生长优势，并得到永生化。白血病分子诊断的主要方法◆识别并正确选用分子标记根据其特异性和敏感性，诊断，预后意义和分层治疗价值，MRD监测的时间窗口◆定性和定量检测的不同运用◆技术方法包括染色体核型分析，FISH,aCGHFCM免疫分型,RT-PCR(qRT-PCR)基因组测序(外显子),SNP分析基因芯片(表达谱)GWASqRT-PCR监测CML患者的Bcr-Abl+微残留克隆第二代测序技术平台单分子实时测序：第三代测序技术ThesensitivityandspecificityofvariousmethodsindetectingtheMRDinAMLCurrentClinicalEvaluationofAMLandpotentialfuturetestingGodleyLA.NEngJ2012:1-2谢谢各位请不吝赐教