大鼠二型糖尿病造模方法

大鼠2型糖尿病模型建立方法讨论专业：药理班级：六班姓名：刘畅学号：150517摘要：据国际糖尿病联合会（InternationalDiabetesFederation，IDF）估计，现在全球约8.3%的成年人患有糖尿病。到2035年，该病患者人数预计会上升至5.92亿。在2013年，全球约有3.82亿成年人患有糖尿病，中国的糖尿病患者人数居全球之首，调查统计人数为1.14亿。糖尿病导致约510万人死亡，平均大约每6秒钟就有1人死于糖尿病。2012年1月9日，中国健康教育中心公布的“中国慢病监测及糖尿病专题调查”结果显示，我国18岁及以上居民糖尿病患病率为2。6%，60岁以上老年人患病率高达19.6%。因此，为治疗糖尿病建立简单、稳定、经济的动物模型非常重要。因2型糖尿病患者人数占糖尿病患病人数的90%以上，本文主要综合讨论高糖高脂饲料联合链脲佐菌素大鼠2型糖尿病模型的建立方法和注意事项。得出结果为：使用体重在190g~240g之间的雄性SD大鼠，通过连续两次腹腔注射小剂量链脲佐菌素并辅以去抗氧化剂处理，合理饲养并通过尾静脉采血方法建立的2型糖尿病模型较理想。关键词：2型糖尿病，SD大鼠模型，链脲佐菌素STZ，糖尿病（diabetes）是一种以胰岛素分泌缺陷和胰岛素作用不足所致的以高血糖为特征的葡萄糖、蛋白质、脂质代谢紊乱的综合征，基本治疗方案包括饮食治疗、运动治疗、药物治疗、糖尿病监测及糖尿病教育。病因主要有遗传因素、病毒感染、肥胖等，临床表现为“三多一少”即多尿、多饮、多食和体重减轻。长期的高血糖最终会引起很多严重的并发症，包括心脑血管疾病、糖尿病神经病变、糖尿病视网膜病变，糖尿病肾病、糖尿病足、感染、糖尿病酮症酸中毒、高渗性昏迷等[1]。糖尿病分为1型糖尿病（Type1diabetes）和2型糖尿病（Type2diabetes）两种，1型患者因自身免疫β细胞破坏所致，每日胰岛素分泌量非常少，空腹基值及糖刺激后峰值均明显低于正常值，表现为绝对分泌不足。2型糖尿病细分为两类：体重正常患者胰岛素分泌量低于正常人，糖刺激后峰值低并且延迟出现；肥胖糖尿病人胰岛素分泌量大于正常人，空腹基值和糖刺激后高峰明显高于正常人，但延迟出现，因此，表现为相对性胰岛素分泌不足且释放反应迟钝。胰岛素分泌不足的原因可能为：遗传因素、自身免疫、胰岛素拮抗。糖尿病患者中约有90%～95%属于2型糖尿病。2型糖尿病，即非胰岛素依赖型糖尿病（non-insulin-dependentdiabetesmellitus，NIDDM），根据体重可分为肥胖和不出现肥胖两类。主要表现为在基因缺陷基础上的组织的胰岛素抵抗（IR）、胰岛β细胞机能障碍导致胰岛素分泌相对不足，区别于自身免疫β细胞破坏所致的1型糖尿病[2,,3]。IR是由遗传和环境因素导致的，机体对胰岛素生理作用的反应性降低，即胰岛素促进葡萄糖摄取作用受损，导致代偿性胰岛素分泌增多，其重要标志为高胰岛素血症。主要表现为外周组织对胰岛素敏感性下降，以及对葡萄糖的利用障碍[4]。致病机制主要有：遗传缺陷、获得型器官官能障碍(AcquiredOrganDysfunction)和生活习惯三大因素。糖尿病是多基因相关的疾病，可能存在很多糖尿病易受性基因[2]，只有如线粒体基因组缺陷和某些特殊糖尿病可以较明确的用基因遗传解释[1]。近年来，生活习惯的影响愈加显著，不良的生活习惯导致、加重胰岛素抵抗，削弱胰岛素分泌从而引发糖尿病，过度肥胖和胰岛素抵抗伴随的过量的脂肪酸会联合过高的血糖使β细胞功能进一步恶化。中国农村的糖尿病发病率为0.1%～0.2%，而城市超过5%[5]。2型糖尿病特征：病程前期长；中老年人群高发；血浆胰岛素水平仅相对降低，糖刺激后延迟释放（有时肥胖病人空腹血浆胰岛素基值可偏高，糖刺激后胰岛素亦高于正常人，但比相同体重的非糖尿病肥胖者为低）；HLA（白细胞抗原）、ICA（胰岛细胞抗体）呈阴性；胰岛素效应低；可用口服抗糖尿病药物控制血糖[3]。降糖药物作用不佳时可使用胰岛素[9]。2型糖尿病患者通常需要长年服用降糖药物，常用一线降糖药只针对消除血糖高现象，未从病因着手，因此患者依然会出现胰岛细胞功能逐渐下降和各种并发症，患者生活质量较低，寿命缩短，经济压力大。因此，为能更深入研究糖尿病的发病机理、潜在治疗因素；更好的创新、研发治疗2型糖尿病药物，构建尽可能与人类有相同2型糖尿病（T2DM）特点的，简单、稳定、经济的动物模型有重要意义。一、模型1.1.造模方法1、2型糖尿病实验性动物模型通常用物理或化学方法致胰腺或胰岛β细胞损伤，从而使胰岛素分泌功能发生障碍，造成胰岛素缺乏[6]。以下为常用造模法：（1）、催肥法：通过对动物模型使用药物刺激（如注射金硫葡萄糖），使其贪食、嗜睡，逐渐提高实验动物的体重，达到增肥目的。并得到高血糖、高胰岛素血症和有胰岛素产生抵抗的动物模型。但此方法成模率低，动物死亡率高。（2）、部分胰腺切除法1889年Minkowski切除犬胰腺成功制作出糖尿病的模型。但造模需手术且不稳定因素多。只从单一方面展现治病因素。现使用较少。（3）、化学诱导法：此类方法操作简单，成本较低，较好控制应用较多。常见三类：①四氧嘧啶（Alloxan）和链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)：四氧嘧啶可抑制葡萄糖激酶和诱导活性氧簇，从而诱发糖尿病。STZ已不对人使用的广谱抗生素，对胰岛β细胞有高选择性毒性作用[7,8]。②烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和小剂量STZ模型：NAD为抗氧化剂清除体内自由基作用从而而降低STZ对胰岛β细胞的细胞毒性。成年Wistar大鼠先腹腔注射NAD，15min后尾静脉注射STZ，形成血浆胰岛素水平维持在正常水平，而伴有稳定的非空腹高血糖症的2型糖尿病模型[9]。③STZ诱导糖尿病：大剂量给予STZ诱导成年大鼠1型糖尿病模型；小剂量给予STZ诱导成年大鼠2型糖尿病模型。单次较大剂量STZ(80～100mg/kg)诱导新生大鼠成年后发展为2型糖尿病。用来研究有关于β细胞的再生、β细胞功能衰减及胰岛素作用缺陷的机制[10]。但单一化学药物通常需较大剂量，毒副作用大，容易引起动物死亡。（4）、高糖高脂联合STZ法：高糖高脂饮食诱导大鼠胰岛素抵抗，之后注射低剂量STZ破坏部分胰岛β细胞功能。胰岛β细胞由于胰岛素抵抗等因素进一步损害，发展为胰岛素分泌功能失偿，出现葡萄糖耐量受损，发展为2型糖尿病[11，12]。此方法构建的模型可以较好的模拟人类II型糖尿病的特点和发展情况，并且成本较低，操作方便[12,13,14]。1.2.动物选择诱发糖尿病的机理有种属差异，不同物种之间的诱发机理差别很大。可用做糖尿病模型的动物种类包括猴、小羊、狗、兔、大鼠、小鼠、仓鼠等，其中鼠类应用最多。除以上实验性2型糖尿病鼠类模型外，另有两大类：(1)自发性2型糖尿病模型；(2)转基因动物模型[15]。1.2.1.自发性糖尿病动物模型在自然条件下或基因突变发生通过遗传育种保留的动物模型。疾病的发生、发展与人类糖尿病非常相似，应用价值高，但较少考虑环境因素，来源较少，种类有限，价格昂贵。①ob/ob小鼠：瘦素基因缺乏，常用于减肥药和抗糖尿病药物的研究和检测。②db/db小鼠：瘦素受体基因缺陷，发病过程与人类二型糖尿病非常相似，出生约一个月后逐渐出现肥胖、高血糖、高血脂、糖尿等糖尿病症状，研究中应用较多。③KK糖尿病小鼠：胰岛素不敏感，对葡萄糖耐量小，糖尿病发病率高，有轻度胰岛素抗性，易表现糖尿病肾病特点。特点为：轻度肥胖、高血糖症、高胰岛素抵抗④NSY(Nagoya-shibata-yasuda)小鼠：具有年龄依赖性，糖尿病发展速度较缓慢。给予高脂食物能够加速其发生过程，且会出现胰岛素分泌不足及胰岛损伤。⑤其他：Zucker大鼠和非肥胖自发性2型糖尿病大鼠：GK(Goto-Kakizaki)大鼠，CD(Cohendiabetic)大鼠。1.2.2.转基因动物模型已有多种转基因或基因剔除小鼠糖尿病模型。相关基因位点：胰岛素受体(insulinreceptor，IR)、胰岛素受体底物(insulinreceptorsubstrate，IRS）：IRS-1、IRS-2、胰岛素分泌相关的GLUT-2、胰岛素样生长因子-1受体、葡萄糖转运蛋白GLUT-4、过氧化物酶体增殖物激活受体PPAR-γ等[1]。二、高糖高脂饮食联合STZ法2.1材料2.1.1试剂链脲佐菌素（STZ）是从无色链霉菌提取出的广谱抗生素，可抗菌、抗肿瘤但因对胰岛β细胞具有高度选择性的杀伤毒性[6]已不使用。STZ注射后迅速作用于胰岛β细胞的特异性毒性、对机体毒性较小使其成为国内外广泛采用的糖尿病动物模型化学诱导剂[16,17]。STZ引起的糖尿病的机制未完全清楚，主要为DNA和线粒体破坏：①含亚硝基，可诱导一氧化氮的合成，通过一氧化氮(NO)和自由基两种途径损伤胰岛β细胞DNA，增加胰岛β细胞的氧化侵袭，诱导多聚ADP核糖基化作用，消耗β细胞内NAD+和ATP，导致β细胞大量坏死[4，5]；②经葡萄糖转运体2(GLUT2)进入β细胞造成DNA烷基化损伤，诱导多聚ADP核糖基化作用[3]。③胰岛β细胞损伤后，激活自身免疫，胰岛β细胞受免疫攻击[21,8]。同一种系动物中STZ致β细胞损伤程度取决于STZ剂量，低剂量诱导大鼠胰岛素细胞（INS-1）调亡，高剂量致β细胞坏死[19]。给药途径为：静脉注射(iv)、皮下注射（sc）、腹腔注射(ip)、心内注射（ic）等[11]。因腹腔注射操作容易、准确快速，现多采用腹腔注射法。高脂饮食使动物肥胖，胰岛素所需量增加，β细胞因过度负荷致细胞衰退，出现高血糖、高血脂等糖尿病症状[19]。2.1.2动物（1）、大鼠品系、性别、年龄（体重）均有影响。①Wistar大鼠成模率低于SD大鼠且死亡率均高于SD大鼠[20]；杨亦彬等人报道：wistar大鼠空腹成模率为62.5%，SD鼠为87.5%，非空腹组成模率仅10%，未成模大鼠空腹下追加小剂量STZ不能成模。成模鼠肾胰显示特征性改变。不同时点血糖值差异大[21]。②年龄影响大鼠对STZ的敏感性，现成年大鼠模型多用200～250g的大鼠制备[1]。③雄性大鼠比雌性大鼠成模率高，稳定性好，耗时短。单纯高糖高脂饮食喂养的雄性、雌性大鼠，血糖血脂无差异，但注射STZ后，雌性鼠对STZ敏感性弱于雄性鼠，雄性大鼠血糖升高并稳定在较高水平，而雌性需要再一次注射STZ，模型才能相对稳定[1,22]。（2）、成模后动物状态：糖尿病SD大鼠在注射STZ后第2即逐渐出现多饮、多食、多尿和体重减轻的“三多一少”症状，且可以一直维持到实验结束。随着病程的发展，逐渐出现毛发竖立无光泽、脱毛、蜷卧拱背、活动减少、伤口易感染和白内障等表现，严重者有尾部僵硬、烂尾、趾端破溃感染[16,22]。胰腺组织变化普通大鼠的胰腺外分泌细胞及胰岛内细胞形态正常，分界清楚。注射STZ的糖尿病大鼠，胰腺外分泌细胞充血，分界不清，明显炎性浸润，细胞核破碎、溶解；胰岛内细胞大量破裂，细胞核变形溶解，残存细胞核数量少，明显分布不均[11]。胰岛变小，密度减低，胰岛分布稀疏，胰岛细胞数量减少、肿胀，胞质着色浅，细胞核固缩[20]。应注意，建模5个月后，大鼠会出现食欲不振、极度消瘦，精神萎靡，行动迟缓，饮水量、尿量明显增加[16]。应在适当时间遵循《关于善待实验动物的指导性意见》进行适当处理并在试验后进行安乐死[23]。2.2指标2.2.1测量除以上描述大鼠成模后体征状态变化，大鼠项指标也会出现变化。基本变化为：建模后约1个月，大鼠各指标异常，空腹血糖值、胰岛素含量、三酰甘油及总胆固醇呈逐渐上升趋势、胰岛素敏感指数呈逐渐下降趋势至实验结束[16]。说明模型存在胰岛素抵抗和糖脂代谢紊乱。指标变化情况[22,11]：血清中胰岛素(INS)空腹血糖（FBG）：FBG≥7.0mmol/L或FBG≥11.0mmol/L胰岛素敏感性指数（ISI)：ISI=ln[1/(FBG×INS)]（HOMA法）[24]低于正常动物（说明胰