RTCA技术原理及应用领域

RTCA(RealTimeCellularAnalysis)技术原理及应用领域技术支持张浩彬艾森生物（杭州）有限公司©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIOLifeScienceResearchModelsPhysiologicalandbiologicalprocessPathologicalconditions:diseasemodelsAnimalCellsGene,DNAMoleculesCellsplayacentralroleinlifescienceresearchRNAProteins,Receptors,etc©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIO细胞接种药物处理标记&终点检测(e.g.optical–absorbance;Fluorescence:FI,FP,FRET;Luminescence:CL,ECL;radioisotope:Filtration,ScintillationProximityAssay)传统终点检测数据分析1-24小时BlackBox传统细胞实验方法©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIO细胞接种药物处理数据分析自动实时动态检测及数据分析RTCA实时无标记检测细胞接种药物处理标记&终点检测传统终点检测数据分析1-24小时BlackBox传统终点检测到实时无标记检测©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIORTCA(RealTimeCellularAnalysis)检测原理基于微电子阻抗技术的细胞检测方法阻抗检测：细胞形态学变化(细胞的大小，形状，贴壁情况，伸展)细胞数量细胞的粘附力©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIO-Eachwellcontainsaninter-digitatedgoldelectrodeonthewellbottom-Eachdigitofthegoldelectrodehasa„stringofpearls“shape-Thegoldelectrodecovers~80%ofthebottomareaCellsonthewellbottom©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIOCellIndex(细胞指数)：无量纲的参数；由测得的阻抗值换算获得；反映细胞表型的变化（增殖、死亡、形态、大小等）细胞指数：什么是细胞指数？©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIO细胞指数和细胞数、细胞粘附力及形态的关系16000800020004000CellNumberCellIndex8.34.61.90.90min5min20min00.20.40.60.810min5min20minTimeCellIndex©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIO细胞黏附伸展细胞对数增殖期如何解读细胞指数曲线？细胞的大小/黏附度细胞的数目©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIO如何解读细胞指数曲线？细胞瞬时形态变化©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIOiCELLigence及xCELLigence系列产品（一）产品培养/处理检测通量细胞增殖/QC/细菌病毒介导的细胞毒性/受体配体相互作用/细胞间作用细胞迁移/浸润心脏毒性/心肌细胞功能数据传输染色/镜检/观察直接成像始终位于培养箱内2x8孔无线WiFi，iPad操作E-plate直接进行视窗直接实现成像，无需平行样始终位于培养箱内1x96孔数据线E-plate直接进行视窗直接实现成像，无需平行样始终位于培养箱内6x96孔数据线E-plate直接进行视窗直接实现成像，无需平行样RTCASP1X96RTCAMP6X96√√××××√××iCELLigence（2012）11©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIOiCELLigence及xCELLigence系列产品（二）产品培养/处理检测通量细胞增殖/QC/细菌病毒介导的细胞毒性/受体配体相互作用/细胞间作用细胞迁移/浸润心脏毒性/心肌细胞功能数据传输染色/镜检/观察直接成像始终位于培养箱内4x384孔√××数据线E-plate直接进行视窗直接实现成像，无需平行样始终位于培养箱内3x16孔√√×数据线E-plate直接进行视窗直接实现成像，无需平行样始终位于培养箱内1x96孔××√数据线E-plate直接进行视窗直接实现成像，无需平行样RTCACardio1X96RTCAHT3844X384RTCADP3X1612©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIORTCA实时无标记动态检测流程©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIORTCA的检测优势DiscoverWhatYouHaveBeenMissingCaptureBiologyAsIthappens©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIORTCA的实时动态检测指示最佳实验流程©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIORTCA的实时动态检测指示最佳检测时间16细胞凋亡检测©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIO受体-配体相互作用细胞迁移和浸润细胞/微环境相互作用细胞毒性RTCA在细胞学研究中的应用细胞质控细胞粘附和伸展病毒CPERatPrimaryCardiomyocytes-0.04-0.0200.020.040.060.080.10.1202004006008001000120014001600MeasurementPoints(DT=12.8ms)CellIndex心肌细胞功能检测新药筛选基因调控ADCC©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIO18RTCA全球部分用户湖北CIQ©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIORTCA传统方法细胞增殖检测细胞毒性或细胞凋亡检测化合物、细菌毒素、病毒和细胞及细胞因子等介导的细胞毒性MTT,XTT,WST-1,³H-thymidineorBrdUincorporationLDHReleasePlaque-formingassays肿瘤细胞与微环境的相互作用CCD配体受体相互作用介导的细胞响应，包括酪氨酸激酶活性Ligand-binding(SPA,Biacore)ReceptorELISAs细胞迁移及浸润BoydenChamberassay/MatrigelassayRTCA在基础研究中的应用——肿瘤细胞学©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIO肿瘤信号传导——检测RTK信号通路的细胞响应TR-FRETELISA现有检测方法：细胞内蛋白水平的检测步骤繁琐成本高大量实验优化©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIOPhalloidinAnti-RacEGFEGFRInhibitor0min5min20min20min+++-+---肿瘤信号传导——RTCA检测EGF/EGFR信号通路的细胞响应0.811.21.41.61.82024681012Time(hours)NormalizedCellIndexEGFInsulin0.811.21.41.61.82024681012Time(hours)NormalizedCellIndexEGF+EGFinhibitorInsulin+EGFinhibitorRTCA检测方法：检测细胞表型的变化简化步骤降低成本捕捉细胞的瞬时及长时效响应©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIO上海市第六人民医院装机实验RTCA检测抗肿瘤药物的细胞毒性作用药物的临床治疗探索单药细胞水平的疗效联合用药、分期用药的剂量、时间药物结合基因调控治疗的剂量、方案设计22200nMPaclitaxel100nMPaclitaxel50nMPaclitaxel25nMPaclitaxel12.50nMPaclitaxel6.25nMPaclitaxelDMSOcontrolOnlymediaA5495kcells/well药处理前一时间点（time:16:43:22）CellMeanCISDCVA549(5000)0.86620.06357.33%药处理一定时间IC50值Time24h48h72hIC5098.6nM97.2nM95.8nM©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIO肿瘤转移过程中的细胞迁移及浸润恶性肿瘤的表现转移的发生与否，常被视作癌症患者病程的严重程度以及治疗效果的指标肿瘤转移则是癌症患者死亡的最主要原因23©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIO肿瘤细胞迁移浸润ConventionalTranswellAssayRTCAMigration/InvasionAssay大大简化实验步骤实时定量检测细胞迁移/浸润©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIO肿瘤细胞迁移浸润——xCELLigence-CIMCIM16WellDevicexCELLigenceDP©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIO–Chemotaxis=directedmovementtowardsolublefactors(chemicals,growthfactors,food,etc.)–Haptotaxis=directedmovementalongimmobilegradient(chemicals,growthfactors,food,etc.)0123450510152025CellIndexTime(hours)40000-10%Serum20000-10%Serum40000SFM20000SFM00.20.40.60.811.21.402468Time(hours)CellIndex20ug/mLFN10ug/mLFN5ug/mLFNBSACtrlRTCA实时监测肿瘤细胞迁移26©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIORTCA研究小分子的细胞迁移抑制作用Locostatin-InhibitorofRKIP5h10h15h20h24h50mM25mM12.5mM6.3mM3.3mM1.6mMSFM10%FBSIC50vs.time14mM17h实现迁移抑制剂的时间量效作用的动态检测时间依赖的IC50检测及计算显示抑制剂的动力学，slow&fastactingcompound？药物对恶性肿瘤细胞迁移抑制的时间效应剂量效应27©2012ACEABIO–ProprietaryandConfidentialACEABIORTCA在基础研究中的应用——免疫学NK细胞介导的ADCC作用肥大细胞的致敏及脱颗粒00.511.522.52030405060Time(Hours)NormalizedCI1