DNA提取原理和方法

DNAextractionZJL2014.05.09•细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白。•真核生物的DNA又有染色体DNA与细胞器DNA之分。前者为双链线性分子；后者为双链环状分子。•除此之外，在原核生物中还有双链环状的质粒DNA；在非细胞型病毒颗粒内，DNA的存在形式多种多样。DNAextraction•极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，钠盐比游离核酸易溶于水。•在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。•天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。核酸的理化性质提取DNA总的原则:1保证核酸一级结构的完整性；2其他生物大分子的污染应降低到最低程度；3核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；4其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。DNA提取的几种方法基因组DNA的提取非基因组DNA的提取质粒DNA的提取断裂成为线状共价闭合环状结构基因组DNA的提取细胞破碎方法应用Ⅰ机械法1匀浆法机体软组织2捣碎法动物韧性组织3研磨法细菌、酵母Ⅱ物理法1超声法细胞混悬液2反复冻融法培养细胞3冷热交替法细菌、病毒4低渗裂解红细胞Ⅲ化学法1有机溶剂细菌、酵母2去垢剂组织、培养细胞3酶解法细菌、酵母根据裂解方式的不同有：吸附材料结合法：根据核酸分离纯化方式的不同有：•硅质材料•阴离子交换树脂•磁珠高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。基因组DNA的提取浓盐法：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物基因组DNA的提取SDS法流程图（以动物组织为例）动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液基因组DNA－SDS法Approximately~1cmoftailiscutandputintoanmicrofugetube;Add0.5mltailsolutionand25mlProteinaseK,mixwellandincubateat55ºCovernightoruntiltissueisdissolved;MoreProteinaseKmaybeaddedifdigestionisnotcompleteafter24hr;Add0.5mlPhenol/Chloroformandvortexattopspeedfor15minatRT;Spinat13,000rpmfor30minatRT;Transferthetopaqueousphasetoafreshmicrofugetube;Add0.5mlChloroformandvortexattopspeedfor5minatRT;Spinat13,000rpmfor5minatRT;Transferthetopaqueousphasetoafreshmicrofugetube,add50ml3MNaOAc(pH=6.0)and0.5ml100%ethanol,invertseveraltimes;ANaOAcsolutionwithpHlowerthan6.0willcausetheEDTAtoprecipitate;Spinat13,000rpmfor5minatRT;Ifthereisnopellet,placesamplesin-80ºCfor10minandspinat13,000rpmfor25minat4ºC;Washpelletoncewith70%ethanol,airdry;ResuspendDNAinddH2O.Use~100-200mlddH2Otogetfinalconcentrationas100ng/mlforPCR.Phenol-chloroformextractionofmousetailDNA1.SDS：十二烷基硫酸钠2.Tris：缓冲液3.EDTA2.Add0.5mltailsolutionand25mlProteinaseK,mixwellandincubateat55ºCovernightoruntiltissueisdissolved;作用：细胞裂解时PH值也能稳定作用：a.溶解细胞膜、核膜上脂质成分b.使蛋白质变性作用：是二价金属螯合剂，抑制核酸酶；降低细胞膜的稳定性。Tailsolution:3.MoreProteinaseKmaybeaddedifdigestionisnotcompleteafter24hr;ProteinaseK:作用：广谱蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性，降解蛋白质，将DNA游离。4.Add0.5mlPhenol/Chloroformandvortexattopspeedfor15minatRT;5.Spinat13,000rpmfor30minatRT;优点：1.有效变性蛋白质；2.抑制了DNase的降解作用。缺点：能溶解10-15%的水，从而溶解一部分DNAPhenol：Chloroform：1.加速有机相与液相分层。2.去除DNA水溶液中残留的微量酚。1.减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。2.有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。Isoamylalcohol：7.Transferthetopaqueousphasetoafreshmicrofugetube;8.Add0.5mlChloroformandvortexattopspeedforminatRT;9.Spinat13,000rpmfor5minatRT;经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。Chloroform：10.Transferthetopaqueousphasetoafreshmicrofugetube,add50ml3MNaOAc(pH=6.0)and0.5ml100%ethanol,invertseveraltimes;11.Spinat13,000rpmfor5minatRT;NaOAc(pH=6.0):1.沉淀核酸，缩短乙醇沉淀的时间2.提供单价阳离子。减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，100%ethanol1.任意比和水相混溶，夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。2.但是加其他比例的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。12.Ifthereisnopellet,placesamplesin-80ºCfor10minandspinat13,000rpmfor25minat4ºC;13.Washpelletoncewith70%ethanol,airdry;14.ResuspendDNAinddH2O.1.DNA则多以弱碱性的Tris或者TE溶解。2.基本上，核酸在保存中的稳定性，与温度成反比，与浓度成正比。DNA的保存：非基因组DNA的提取碱裂解法密度梯度离心法煮沸法质粒DNA的提取1、培养细菌使质粒扩增---对数生长后期2、收集和裂解细菌3、质粒DNA的纯化质粒DNA的提取--碱裂解法1、培养细菌使质粒扩增---对数生长后期在含有相应抗性的液体培养基中培养已转化质粒的细菌(单克隆)，使细菌快速增殖的同时质粒DNA得到大量扩增。37oC振荡过夜质粒DNA的提取--碱裂解法2、收集和裂解细菌非离子型/离子型去污剂裂解有机溶剂/碱加热质粒DNA的提取--碱裂解法3、质粒DNA的纯化---CsCl-溴化乙锭梯度密度离心取决于线状DNA与闭环DNA与溴化乙锭结合的量质粒DNA的提取--碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。质粒DNA的提取--碱裂解法离心洗涤对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液质粒DNA的提取--碱裂解法SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液的成分及作用溶液ⅠResuspensionBuffer成分：50mM葡萄糖/10mMEDTA/25mMTris-HCl，pH=8.0葡萄糖:增稠。维持渗透压，防止DNA受机械切力作用降解。EDTA:二价金属离子的螯合剂，抑制DNase的活性。有利于溶菌酶的作用。这一步溶液中还可以加入RNase溶菌酶：糖苷水解酶。当溶液中PH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。溶液ⅡLysisBuffer成分：0.2MNaOH/1%SDSNaOH：溶解细胞，DNA变性SDS：(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。(2)解聚细胞中的核蛋白。(3)SDS能与蛋白质结合成为复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。SDS与NaOH联用：增强NaOH的强碱性SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液的成分及作用SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液的成分及作用溶液ⅢNeutralizationBuffer成分：3MKAc/2MHAcKAc:K+置换了SDS中的Na+，得到PDS沉淀HAc:中和NaOH,使DNA复性吸附柱SpinColumnwithCollectionTubes结构：特殊硅基质吸附材料，特异性吸附DNA，而RNA与蛋白质穿过。高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。大提&小提区别：1.大提可以用于大量菌液的提取，100ml-500ml均可，而小提用的菌液量很少，一般1.5-5ml。2.一般试剂盒中大提比小提多了溶菌酶、异丙醇（回收沉淀核酸）、LiCl（特异性去除RNA）、含一定量PEG的氯化物（回收质粒DNA）及乙酸铵等，其作用及目的都是有利于细菌的裂解和质粒的纯化，所以大提的产物比小提的量多很多，而且纯度很高。3.小提一般用于质粒鉴定和对纯度要求不是很高的实验，大提用于质粒的大量提取和转染等纯度要求很高的实验。*内毒素的去除•内毒性也称为脂多糖或LPS，是革兰氏阴性胞膜上一种成分，细菌外膜的外部脂质完全由内毒素分子组成。•包含疏水区域也包含了亲水和带电区域，从而赋予其与其它分子相互作用的独特性质。•细菌在其活跃生长时表面的内毒素成分较少，而一旦其死亡则会释放大量内毒素。在质粒提取的裂解过程中，内毒素会从细菌的外膜释放到裂解液中。•内毒素会对原代细胞的DNA转染产生严重影响，同样也会影响培养细胞的敏感性，内毒素水平增加可导致转染效率的大幅下降。原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。煮沸法是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。差速离心法Thankyou!