4第四章发酵与酿造工程学基础及主要设备1

第四章发酵与酿造工程学基础及主要设备第一节发酵与酿造的工艺过程一、菌种活化与扩大培养种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。种子扩大培养的概念:种子扩大培养的目的与要求种子扩培的目的接种量的需要菌种的驯化缩短发酵时间、保证生产水平种子的要求：总量及浓度能满足要求生理状况稳定，个体与群体活力强，移种至发酵后，能够迅速生长无杂菌污染（一）种子制备的技术概要1.种子制备的过程实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。2.实验室阶段接入斜面/平板，培养成熟后，挑选孢子，再一次接入斜面/平板，进行活化。(两次转接)A、砂土管或冷冻干燥管菌种活化可采用固体培养基培养孢子，直接作为种子罐的种子。举例:产黄青霉菌，采用大米或小米为固体培养基，装入摇瓶、灭菌，耍注意控制米粒含水量，使米粒不粘不散。接入孢子，25-28℃培养14d。培养结束，将孢子瓶于真空下抽去水分，使含水量10％以下，冰箱保存备用。B、产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以用摇瓶液体培养法，孢子接入液体培养基，振荡培养，获得菌丝体，作为种子。例如：灰色链霉菌、卡那链霉菌。C、产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。斜面菌种于32℃，培养18-24h，即可移入250mL摇瓶液体培养基，32℃培养12h，即可作种子罐种子。例如：谷氨酸棒状杆菌。D、不产孢子的细菌一般保存在麦芽汁琼脂培养基或MYPG培养基的斜面上，4℃冰箱保存.每年移种3-4次。斜面菌种→接入含10mL麦芽汁试管→25-27℃培养2-3d→扩大至三角瓶→25℃培养2d→移至含5-10L麦芽汁的罐→15-20℃培养3-5d→含100L麦芽汁的发酵罐。E、生产啤酒的酵母菌MYPG培养基：3g麦芽浸出物，3g酵母浸出物，5g蛋白胨,10g葡萄糖,20g琼脂,1L水。3.生产车间阶段采用易被菌利用的成分，如葡萄糖、玉米桨、磷酸盐等，同时还需供给足够的无菌空气并不断搅拌，使菌丝体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。种子罐培养原则：摇瓶菌丝体种子：种子罐之间或发酵罐间的移种：接种方法：可在火焰保护下接入种子罐或采用压差法接入。主要采用压差法，由种子接种管道进行移种，移种过程中要防止接受罐表压降至零。生产车间种子制备工艺可控参数:种子罐级数种龄接种量A种子罐级数的确定种子罐级数指制备种子需扩大培养的次数.种子罐级数的意义：种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少移种带来染菌机会。但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率。因此，种子罐级数不宜过少。种子罐级数随菌种及规模而定，也与工艺条件有关。优化种子罐培养条件，加速孢子发芽及菌体繁殖，也可减少种子罐的级数。（1）生长快的细菌，种子用量少，种子罐相应也少。例如：谷氨酸生产中，菌接入种子罐32℃培养7一10h，即可接入发酵罐作为种子，这称为一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。（2）生长较慢的菌种，种子用量大，种子罐相应也多。例如：青霉素孢子悬液接入一级种子罐（发芽罐）于27℃培养40h，孢子发芽，长出短菌丝。再移至第二级种子罐（繁殖罐），27℃培养10-24h，菌丝迅速繁殖，获粗壮菌体，即可移至发酵罐，这称为二级种子罐扩大培养，也称三级发酵。一般50m3发酵罐都采用三级发酵。（3）生长更慢的菌种链霉素生产菌种灰色链霉菌，一般采用三级种子罐扩大培养。在小型发酵罐(5-30L)进行试验时，也有采用直接孢子或菌丝体接入罐中发酵，称一级发酵。接种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。接种龄以菌丝处于对数生长期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为合适。过于年轻的种子：前期生长缓慢、发酵周期延长、产物形成推迟，甚至会因菌丝量过少而在发酵罐内结球，造成异常发酵的情况。过老的种子：会引起生产能力下降，菌丝过早自溶。不同品种或同一品种的工艺条件不同，接种龄是不一样的，要经试验，确定最适接种龄。B接种龄移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。接种量大小决定于菌种在发酵罐中生长繁殖的速度。例如：抗生素发酵的最适接种量为7-15％，有时可增加到20-25％。而谷氨酸发酵只需1％。C.接种量大接种量：可以缩短发酵罐中菌丝繁殖到达高峰的时间，使产物的形成提前，且生产菌迅速繁殖，可减少杂菌生长机会。原因：??(a、种子量多b、种子液含大量水解酶类，利于利用基质)接种量过多：往往使菌丝生长过快、培养液粘度增加，造成溶解氧不足，而影响产物的合成。嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶：1％接种量产酶活力最高，超过4％酶产量明显下降。接种量过小：除了延长发酵周期外，往往还会引起其他不正常情况。例如：在头孢菌素生产中，由于接种量过小，会产生大量菌丝团，而使产量降低，但有的抗生素如制霉菌素，用1％接种量比用10％接种量的效果好，而0.1％接种量与1％的效果相似。近年来，生产上多以加大种子量及采用丰富培养基作为获得高产的措施。双种法：有的产品采用二只种子罐接一只发酵罐，如卡那霉素生产中采用双种比单种的发酵单位提高8％，而且达到产量高峰的时间提前。倒种法：即以适宜的发酵液倒出适量，给另一发酵罐作种子．例如链霉素发酵中，使用倒种法比单种的发酵单位提高12％。而四环素发酵采用双种效果并不显著。(1)原材料质量生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。(什么引起原料质量波动?)A.影响种子质量的因素原材料质量的波动，起主要作用的是无机离子含量不同，如微量元素镁、铜、钡能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。4.种子质量的控制例1：四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。例2：制备霉菌用的大(小)米，其产地、颗粒大小、均匀程度不同，孢子质量也不同。例3：蛋白胨加工原料不同，对孢子影响也不同。例4：琼脂的牌号不同，其中含无机离子的差别而引起孢子质量的变化。例5：水质的硬度、污染程度对生产均有影响。(2)培养条件①温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。例如：土霉素生产菌种在高于37℃培养时，孢子接入发酵罐后，表现出糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。②湿度斜面培养基湿度对孢子数量和质量有较大影响。例如：土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子制备时发现：北方气候干燥地区孢子斜面长得较快，在含少量水分的试管斜面下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干瘪状，孢子稀少。在气温高湿度大的地区，斜面孢子长得慢，主要由于试管下部冷凝水多而不利于孢子形成。③通气量种子罐有足够的通气量可以提高种子质量。例如:青霉素生产，将通气充足和不足情况下得到的种子分别接入发酵罐，发酵单位相差1倍。但也有例外例如：土霉素生产中，一级种子罐的通气量小对发酵有利。(3)斜面冷藏时间例如：土霉素生产菌种，孢子斜面培养4d即于4℃冰箱保存，冷藏7-8d菌体细胞开始自溶。而培养5d以后冷藏，20d未发现自溶。例如：链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18％。斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。为保证种子质量，除保证培养条件外，还要定期取样测定一些参数，以观察基质的代谢变化及菌丝形态是否正常。1).pH2).培养基灭菌后磷、糖、氨基氮的含量3).菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观(色素、颗粒等)4).其他参数，如接种前抗生素含量、某种酶活力等B.种子质量的判断测定的参数:用酶活力来判断种子的质量是一种新的尝试：例如：土霉素发酵中，种子液的淀粉酶活力与发酵单位有一定关系。淀粉酶活力高的，接入发酵罐后土霉素发酵单位也高，反之则低。（1）菌种稳定性的检查生产菌种，必须保持稳定的生产能力，虽然菌种保藏在休眠状态的环境中，但微生物或多或少会出现变异的危险，因此定期考察及挑选稳定菌种十分重要。方法：取少许菌种，逐级稀释，划线培养。挑出形态整齐、孢子丰满的菌落，摇瓶试验，测定生产能力。C.种子质量的控制（2）无(杂)菌检查种子制备过程中，每移种一步，均需进行杂菌检查。方法：镜检、肉汤或平板培养、种子液生化分析。生化分析项目：营养消耗的速度、pH变化、溶氧利用情况、色泽、气味有否异常等。（二）种子制备过程举例1.谷氨酸生产的种子制备制备过程斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵（1）斜面(AS1.299)培养基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化钠0.5琼脂2%，pH7.0-7.2培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：32℃，生长18-24小时生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过3次（2）一级种子（摇瓶）培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培养12小时。培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆2.5%，K2HPO40.1%培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基（3）二级种子(种子罐)培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%(10%)），32℃培养7-10个小时培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基种子的质量要求：108-109个/ml大小均匀，呈单个或八字排列PH7.0-7.2时结束，6.8→8→7.0-7.2活力旺盛2.青霉素生产的种子制备制备过程安培管→斜面孢子→大米孢子→一级种子→二级种子→发酵（1）斜面孢子培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细培养条件：25℃、7天,注意湿度50%左右（2）大米孢子培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。培养条件：25℃、7天，控制湿度大米孢子的要求：1粒米含1.4*10个孢子（3）一级种子培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆目的：长菌体培养条件：27℃，40小时接种量：200亿孢子/吨（4）二级种子培养基：同上培养条件：27℃、10-14小时接种量：10%种子的质量要求菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少。青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期，4-6期合成青霉素的能力最强二、发酵与酿造原料前处理及培养基的制备培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。发酵培养基的作用：满足菌体的生长促进产物的形成发酵培养基的要求①培养基能够满足产物最经济的合成。②发酵后所形成的副产物尽可能的少。③培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。④所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。（一）培养基的类型及功能培养基按其组成物质的纯度、状态、用途可分为三大类型1.按纯度合成培养基:原料其化学成分明确、稳定适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业生产天然培养基:采用天然原料原料来源丰富(大多为农副产品)、价格低廉、适于工业化生产原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性M培养基(1L)：Na2HPO46g，KH2PO43g，NaCl0.5g，NH4Cl1g，MgSO4.7H2O0.5g，CaCl20.011g，葡萄糖2-10,pH7.0YPS培养基：酪蛋白胨（日本大五营养）10g，酵母提取物（英国Oxoid）5g,NaCl10g，PH7.2培养大