QPCR常见问题

QPCR中常见的问题Q：ROX是什么，有什么作用？A：ROX是一种荧光染料，作为参比信号校正。试剂中必须包含固定浓度的ROX，这样由于反应总体积的差异、所在孔的位置不同、试管壁的厚度差异、管盖透光性能的差异等所引起的荧光信号波动都能够被扣除，使数据真正反映PCR进程。ROX校正能够极大地改进定量的精确度，提高重复管之间的数据重现性。Q：荧光通道的选择？A：定量PCR实验必须使用ROX校正荧光，占去一种荧光。TaqMan探针的淬灭基团(TAMRA)也要占用一种荧光，对于4色检测的仪器来说，只剩下2种荧光可以标记探针，对于5色检测的仪器还有3种荧光可以使用。如果将探针改用TaqManMGB探针，由于它的淬灭基团是不发荧光的，比之TaqMan探针就可以多1种荧光用于标记探针。如果实验要求不高，不做ROX校正（AB公司不推荐这样做），还可以再多一种荧光用于标记探针。研究应用本身的要求。如果研究SNP和基因突变，因为绝大多数人类基因是2态的，只存在两种等位基因，2条探针已经足够。如果研究基因表达，通常是两两比较居多，比如处理比未处理，正常比异常等，加上一个内对照，3色也就足够了。Q：内标法和外标法哪种数据更精密？A：是同样可靠的。内标的优点在于目标基因与管家基因的反应条件最接近一致，缺点在于目标基因与管家基因的引物和探针相互之间会发生竞争与抑制，导致它们的PCR效率有差异。外标的优点在于目标基因与管家基因的引物和探针之间没有发生竞争与抑制的机会，但是不同管之间的反应条件差异比同管的要大，也会导致它们的PCR效率有差异。两相比较，内标法与外标法的数据精确度是一样的。荧光定量PCR问题疑难解答这两天我做标准曲线，线性关系还行，R2=0.998。但是扩增效率只有另外扩增曲线也不光滑。2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的只有100-200左右。A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大；或者是扩增产物太少了。扩增效率差有引物、试剂和PCR条件的原因。可以做温度梯度摸索实验，寻找最佳退火温度（扩增子的影响）；还可以增加Mg离子的浓度；如果其他条件都好了，还不行，那就是引物的原因。样品稀释准确很重要，做标准曲线不好的很多原因是倍比稀释的问题，正常情况10倍比稀释时前后是相差3.32个循环。Q：荧光定量PCR的灵敏度？A：对于染料法的荧光定量来说，Cq值在13~30之间比较准确，30~33之间需要再次确认，在以上范围内的置信度比较差。Q：标准曲线要重复两三次吗?A：不是，只是用来做标准曲线的梯度点最好不要少于4个，否则标准曲线准确性不高。Q：关于荧光定量标准曲线的制作？A：一般的仪器虽然声称能进行单拷贝检测，但如果不是特别设计的体系很难做到100拷贝以下的准确定量。一般用来做标准曲线的最小浓度为1000拷贝，再往下可靠性就降低了。这不是稀释或其他什么问题，而是本身你选作标准曲线的浓度以及定量浓度最好不要低于1000拷贝，100拷贝也勉强可以接受。否则即使做出来，认可度也不会太高。Q：熔解曲线高矮是什么意思？A：Tm值相同，而峰高低有差异是表达丰度不同。同样的扩增产物也会出现Tm值有微小差异，一般差异在1度以内都可以接受。熔解曲线的纵坐标表示荧光信号对温度的一阶负导数。Q：定量PCR没有扩增？A：把定量PCR的产物跑个电泳看有无产物，如果电泳有条带说明PCR是成功的，只是荧光信号没有读取到，这时要调整染料或探针的浓度。如果电泳没有条带，那么还要在定量PCR仪上优化实验条件。虽然你在普通PCR仪上优化过条件，但换了定量PCR仪，由于两台仪器的升降温速度及温度精密度等指标存在差异同样的条件做不出PCR也是可能的。Q：荧光定量real-timePCR重复性问题？A：建议不要只加1ul，而是稀释10倍左右然后加10ul这样有助于改善重复性。如果你测的是拷贝数重复性不好是很难避免的。我感觉用SYBRgreen作realtime的误差还是比较大的，它的优势在于灵敏度高但如果想精确定量还是比较困难的。探针法特异性最好。Q：扩增时忘了做熔解曲线了，现在是不是没法再做融解曲线了？A：把定量PCR产物重新作熔解曲线，只是新建立一个反应，反应条件按照熔解曲线的条件设定就可以了没必要重新作定量Q：荧光阈值高怎么改进?A：阈值取决于基线，基线是3~13cycles左右的荧光信号值标准偏差10倍。可能是背景高，把模板纯化一下。就可能是模板浓度较高，起峰早导致的阈值线过高。Q：荧光定量PCR检测灵敏度和线性范围的关系？A：一般大家认为的检测灵敏度即检测下限，可以理解为能检测到和准确定量的最低浓度(拷贝数)。而线性范围为能够检测的区间，即可以检测及分辨的最低浓度到最高浓度的数量级。但两者都与荧光定量PCR仪器及试剂体系相关。Q：realtimePCRCq值一般在多少后认为模板没扩增？A：当进入对数期的循环数大于35个时，RealTimeRT-PCR检测无效基因没有表达。当进入对数的循环数在32-35个循环时，需要有至少3个重复才能判断是否能检测到基因的表达。Q：正常情况NTC是不应该出现Cq值的吗？如果是探针法，应该没有Cq值。如果是染料法，可能在30个循环后有微弱起峰，并且软件计算出Cq值。这时还要观察熔解曲线，看扩增产物是否是引物二聚体。如果溶解曲线的Tm值在80度以下那么很可能是引物二聚体，这时也可以优化条件比如提高退火温度等。如果溶解曲线是双峰或更多峰，其中有与加模板后的扩增产物的Tm值相同的峰那么就意味着存在污染。如果是探针法阴性对照起峰肯定是污染。Q：realtimePCR无结果，而用产物跑电泳条带很清楚，什么问题？A：因为加样的时间太长了，荧光染料暴露时间太长荧光基团淬灭了；出现上述问题还有一种情况，就是荧光PCR仪的荧光采取信号值太低。如果使用探针法有荧光信号而没有求出Cq值，可能探针浓度有问题。Q：最佳荧光采集温度？A：采集荧光的时机不是取决于温度而是取决于采用的方法。染料法*一般要在延伸阶段的末点进行检测，而72度延伸的效率最高所以采用染料法时大多在72度检测。如果扩增产物中存在引物二聚体，也有采用更高的读板温度比如76度、80度等。TaqMan探针法*由于TaqMan探针是累积荧光，理论上说在任何步骤检测都可以但目前TaqMan大多采用两步法，所以在退火的末点进行检测即可。分子信标法*就要在退火的末点进行检测。FRET探针法*要在退火时进行荧光检测。Q：定量PCR中质粒作为标准分子为何要线性化？A：因为要检测的目的基因应该是线性的。而目的基因确是连接在环状的质粒上的。所以首先需要质粒线性化并保证完全酶切，然后要回收。注意线性化的质粒不容易保存。所以如果有实验证据证明不线性化的质粒可以用那就可以省去很多事情了。Fig.6alsoshowstheefficiencyofthePCRreactionisnotalteredbyusingcircularplasmidDNAinplaceoflinearisedplasmidDNA.线形化与环状质粒比较文章。这篇文章用这个质粒对线性化和非线性化做了比较，从实验结果看线性化并没有对标准曲线产生任何改变。但是这篇文章只是摆出了试验结果并没有从原理上分析这个实验结果的原因。因此线性化对于标准曲线的作用并不能以这篇文章的结果来外推。就是说可能需要更多的实验结果。或者从原理上分析了这篇文章的结果才能得出结论来说明。Q：realtimepcr不同基因之间的阈值(threshold)是不是要一样啊?A：如果做标准曲线或者相对定量建议阈值还是一样比较好。而且阈值一般要放置于扩增曲线的指数段，即荧光数据对数坐标轴下的线性段。如果扩增曲线的效率接近，阈值线的位置对于定量结果的影响是微乎其微的。Q：扩增曲线本底不断升高是什么原因?A：1、试剂质量差是主要原因；2、模板不纯是一个重要原因；Q：只要Cq值大于30都是阴性吗？A：要与对照品比对才能定性分析。不过一般Cq值大于30结果置信度降低，需要多次确认。常规修饰基团分子量5’-Biotin……405.453’-TAMARA……623.605’-(6FAM)……537.463’-Dabsyl……498.495’-HEX……744.133’-(6FAM)……569.465’-TET……675.243’-AminoModifierC3……153.075’-Cy5……533.633’-AminoModifierC7……209.185’-Cy3……507.593’-ThiolModifierC3……154.12Q：待测基因的Cq值大多在18~25之间，但内参的Cq值很低。第一次做时基本都在10左右，将模板稀释10倍后第二次的内参照的Cq值还是在12~14之间。以这样的数据分析会影响结果的准确度吗？A：每次都做阴性对照并且阴性对照Cq为0，那Cq30就肯定不是污染，而是基因表达量低或是模板太稀。内参Cq为10~14都正常，没必要再稀释模板了。不过内参Cq低于10，结果可能会有偏差。Q：请问下现在的PCR荧光诊断试剂盒里面，国家规定都要求要有临界阳对照吗？这些对照品是不是一定要和样本一起提取呢？还有临界阳用阳性对照来稀释来得到可以吗？A：阳性对照和阴性对照必须要和样品一起提取，进行平行实验，这样才有作为对照的意义。临界阳性样品是不能通过阳性对照稀释的，除非你知道临界阳性的浓度，经过定量标定将阳性对照稀释到临界阳性。Q：realtimePCR结果熔解曲线中出现了负值？A：这个曲线反应的是随着温度的变化荧光值的变化速率。值越高，则此时PCR产物荧光值变化越快，也就是说PCR产物变性速度最快。当温度达到Tm值时PCR产物迅速变性，荧光值急剧下降，表现在这张图上就是出现一个峰。产物越纯，峰越窄，PCR产物越多，峰越高。这样看来出现负值表明此温度下PCR产物变性速度没有两边的温度是快。70-80度时，已经出现变性，但是较为缓慢。但是你的产物看来不是特别纯，峰比较宽。