水稻原生质体制备及转化方法

原生质体制备及转化1.去皮的日本晴种子在75%的酒精中消毒1min。然后用2.5%的次氯酸钠消毒20min。用无菌水洗至少5次，然后在1/2MS培养基上，12h光照（大约150umolm-1s-1）十二小时黑暗，26℃培养7-10天，提前一天烧好去尖的黄蓝枪头备用。2.取40-60棵水稻幼苗的茎和叶鞘的绿色组织。3.将一捆水稻植株（大概10棵幼苗）用剃刀一起切成大约0.5mm的小段。4.将小片段立刻放进0.6M的甘露醇中，黑暗中放置10min。5.用100目钢制滤网去掉甘露醇，将小片段放在加入15mL酶液的25mL锥形瓶中，（1.5%CellulaseRS，0.75%MacerozymeR-10，0.6M甘露醇，pH5.7的10mMMES，10mMCaCl2，0.1%BSA），28℃摇床中轻轻摇晃（50rpm），黑暗孵育4-6h。6.此时配置40%的PEG4000，酶消化后，分三次加入等体积15mL的W5溶液（154mMNaCl，125mMCaCl2,5mMKCl，pH5.7的2mMMES）。用手充分摇晃10s。7.用400目钢制滤网过滤得到原生质体在圆底管中。8.80g离心（升降速度设为1档）5min，缓慢吸走上清液。9.沿壁缓慢加入4mLW5溶液，轻轻悬浮，再离心80g，5min，弃上清10.沿壁缓慢加入4mLMmg溶液，离心80g，5min，弃上清11.再加Mmg溶液，补至每个样品100μl原生质体12.分装2mL离心管，每100μl原生质体，加入20μl质粒和120μl新鲜制备的40%的PEG4000，混匀13.28℃避光静置转化20--25min14.加1.5mLW5溶液混匀，80g离心3min，弃上清。15.重复步骤1416.加2mLW5溶液重悬，轻轻混匀，移到细胞培养板，锡箔纸包裹避光28℃避光静置培养15-20小时17.培养完成后，将培养板中沉淀的原生质体轻轻混匀，吸到2mL离心管中，80g离心3min，弃上清，保留100μl上清液18.共聚焦显微镜观察拍照配制溶液方法：I：配成母液试剂名称MW母液浓度质量配制体积甘露醇（D-Mannitol）182.170.6M54.651g500mLCaCl2110.981M5.51g50mLBSA2%0.4g20mLKCl74.550.1M0.373g50mLMESpH5.7195.240.1M0.98g50mLMgCl2·6H2O203.30.1M1.017g50mLPEG4000现配(W/V)酶液试剂10mL30mL终浓度CellulaseRS0.15g0.45g1.5%MacerozymeR-100.075g0.225g0.75%D-Mannitol7.5mL22.5mL0.6MMES1mL3mL10mMCaCl20.1mL0.3mL10mMBSA(2%)0.5mL1.5mL0.1%加ddH2O补足10mL(~0.9mL)30mL(~2.7mL)W5溶液试剂60mL100mL终浓度NaCl0.54g0.9g0.9%CaCl20.8325g12.5mL125mMKCl3mL5mL5mMMES1.2mL2mL2mM加ddH2O补足60mL(~52.5mL)100mL(~85mL)MMG溶液试剂5mL50mL终浓度D-Mannitol2.5mL25mL0.4MMgCl20.75mL7.5mL15mMMES0.2mL2mL4mM加ddH2O补足5mL(~1.55mL)50mL(~15.5mL)PEG(5mL)试剂5mL10mL终浓度PEG40002g4g40%(W/V)D-Mannitol1.25mL2.5mL0.2MCaCl20.5mL1mL0.1M加ddH2O补足5ml(~1.25mL)10mL(~2.5mL)