实验二PCR扩增(聚合酶链式反应)

实验二PCR扩增（聚合酶链式反应）一、实验目的1.学习聚合酶链式反应概念及技术方法；2.掌握聚合酶链式反应操作过程。二、实验原理（聚合酶链式反应）PCR是聚合酶链式反应，是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热TaqDNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在TaqDNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成1．模板DNA的变性模板DNA加热到90-95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。2．模板DNA与引物的退火将反应混合物温度降低至37-65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为1-2min。3．引物的延伸DNA模板-引物复合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72℃条件下，TaqDNA聚合酶催化的合成速度大约为40-60个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需2-4min，一次PCR经过30-40次循环，约2-3h。扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时，酶的催化反应趋于饱和，便出现所谓的“平台效应”，即靶DNA产物的浓度不再增加。PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸，其5'端是固定的，3'端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段”）结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5'端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。PCR的反应历程变性退火延伸二、药品耗材ddH2O、Buffer、dNTP、Taq酶、样品DNA、SSR引物、移液枪头、离心管、冰盒、冰。三、仪器设备热盖PCR仪、涡旋仪、移液枪、制冰机。四、方法步骤（一）混合体系配制建立10μL扩增体系，按下表进行计算所需混合体系中各物质的量，完成下面表格的填写，并按表格内容在离心管中进行体系配制，配好的混合体系使用涡旋仪进行混匀。扩增的反应体系序号扩增的反应体系扩增的反应体系(μL)反应数量(个)混合体系量(μL)1ddH2O6.2210×Buffer13dNTP(2.5mMeach)0.6854Taq(5UμL/)0.15Primer(25μM)16DNA(10ng/μL)1--（二）PCR扩增程序设置按以下温度及时间在PCR仪上进行程序设定：预变性：95℃用时5min进入循环：变性94℃用时30s；退火：50-55℃用时30s；延伸：72℃用时30s；循环35次后，温度降为72℃，持续反应7min。五、实验注意事项1.操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度。2.避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面。3.注意枪头混用问题，严禁与其它PCR产物分析枪头混用，避免产物间相互污染。4.在实验过程中戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套。六、思考题1.Mg2+离子的作用是什么？Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。2.变性与退火过程中温度过低对PCR产物的影响？变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性：退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。3.引物浓度对产物的影响？引物的与模板的互补程度决定了PCR的特异性，常用0.1-0.5uM，浓度过高则特异性下降，会形成引物二聚体影响试验结果。