感染性克隆的发展及应用

感染性克隆与反向遗传操作感染性克隆病毒的感染性克隆是一种对于真核细胞具有感染性的病毒基因组全长克隆的质粒形式将病毒基因组的全长DNA或cDNA克隆整合到载体中能在E.coli中稳定存在和复制通过体外转录成RNA或直接转染后,具有感染真核细胞的能力因此，它既能在原核细胞中存在也能在真核细胞中增殖传代.概述反向遗传学(ReverseGenetics)是相对于经典遗传学而言的。经典遗传学是从生物的表型、性状到遗传物质来研究生命的发生与发展规律的，反向遗传学则是直接从生物的遗传物质入手来阐述生物生命发生的本质现象，与之相关的各种技术统称为反向遗传学操作技术(ReverseGeneticManipulaton)。感染性克隆与反向遗传操作的发展开创了病毒研究的新时代感染性克隆与反向遗传操作为研究病毒生命行为、致病机制以及病毒与宿主细胞间的相互作用提供了技术平台借助基因组感染性克隆来研究病毒，不再是脱离病毒整体孤立地研究单个基因、单个蛋白，而可以从整个基因组水平来研究错综复杂、相互关联的基因组合蛋白组病毒感染性克隆发展及应用技术支撑重组DNA技术RT-PCR技术体外转录技术人工诱变技术病毒RNA的提取技术异硫氰酸胍分离技术已逐渐被商品化的RNA分离试剂盒所替代试剂盒可以得到高纯度和高浓度的RNA可以减少环境污染导致的RNA降解RT-PCR技术两步法一步法超长RT-PCR体外、体内转录技术体外转录技术是利用RNA聚合酶将基因组cDNA拷贝转录成RNA体内转录是将cDNA返回到RNA的过程转移到细胞内完成人工引入转录终止。又称为流产转录（runofftranscription),是人为在基因组全长cDNA克隆3’端终止RNA聚合酶的合成作用定点诱变技术单点诱变多点诱变体外、体内转录技术体外转录技术是利用RNA聚合酶将基因组cDNA拷贝转录成RNA体内转录是将cDNA返回到RNA的过程转移到细胞内完成人工引入转录终止。又称为流产转录（runofftranscription),是人为在基因组全长cDNA克隆3’端终止RNA聚合酶的合成作用RNA病毒的感染性克隆DNA病毒的感染性克隆基因组50kbDNA病毒的感染性克隆基因组50kbDNA病毒的感染性克隆正链RNA病毒的感染性克隆负链RNA病毒的感染性克隆分节段与不分节段负链RNA病毒的感染性克隆DNA病毒感染性克隆发展及应用DNA病毒感染性克隆的产生在1979年,Israel等在E.coli中克隆了一种小的哺乳动物病毒(polyomavirus)的全长基因组.该病毒约5kb的双链DNA基因组通过限制性酶切被连接到pBR322质粒中.当被克隆的病毒基因组DNA从E.coli载体中释放再接种小鼠或体外转染鼠细胞后均能产生病毒感染.“感染性克隆”由此产生.已构建感染性克隆的DNA病毒•人腺病毒(HADV),(1986)•杆状病毒•鼠巨细胞病毒(MCMV),(1997)•单疱疹病毒-1(HSV-1),(1998)•猪伪狂犬病毒(PRV),(1999)•人巨细胞病毒(HCMV),(1999)•马立克氏病毒-1(MDV-1),(2000)•几内亚猪巨细胞病毒(GPCMV),(2000)•鼠γ疱疹病毒-68(MGHV-68),(2001)•牛疱疹病毒-1(BHV-1),(2001)•猕猴巨细胞病毒(RCMV),(2002)•牛痘病毒(VAC),(2002)E.coli致育因子(fertility,F)•F因子是一个约100kb的质粒,编码60多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质•F+性状作为染色体的标记,可以高效地转移给受体细胞(F-),提示接合转移需要一个可传递的致育因子,该因子被命名为F.•F因子可以整合到宿主染色体中,并且以超常的高频率转移遗传标记.F因子的生物学特性低拷贝数(1-2个分子/细胞)，低拷贝数加上细胞的隔绝环境,限制了细胞内质粒分子间的重组能容纳非常大。自然发生的F因子能携带1/4的E.coli染色体而不显张力或不稳定。易于操作。由于F因子呈闭环结构,所以可以用一些常规的原核基因操作技术将它直接从E.coli中分离出来。人工染色体(artificialchromosome)的发展为DNA病毒感染性克隆与反向遗传操作的建立奠定了技术基础.F因子的特性使其作为基因组DNA的高容量载体具有独特的魅力.1987年,克隆容量可达几百甚至上千kb的酵母人工染色体(Yeastartificialchromosome,YAC)问世,使通过同源重组的方法在酵母中对基因组大片段的操作成为可能。但是,YAC内部存在嵌合及重组YAC1989年，O’Conner首次用“染色体建造”的方法，利用F因子构建载体pMBO131来克隆大片段DNA.BAC1992年,Shizuya等以pMBO131为基础,将T7、SP6启动子序列，含cosN和loxP位点的λ和P1噬菌体片段分别插入pMBO131中，构建了可以容纳300kb以上的载体pBAC108L，从而建立了细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)。发展中的细菌人工染色体BAC载体的基本结构parA、parB和parC,分裂必需的3个基因oriS决定DNA的单向复制repE编码复制所必需的蛋白质E.Cmr(氯霉素抗性基因),选择性标志基因lacZ元件,通过α互补的原理区分重组子cosN和loxP，分别来源于λ和P1噬菌体。其中cosN可被λ噬菌体的末端酶切割，loxP可由P1噬菌体的Cre蛋白识别和切割BAC载体骨架图谱其它人工染色体PAC：来源于P1的人工染色体(容量300kb）HAC：哺乳动物人工染色体(容量300kb）BAC的优点尽管BAC的容量最大仅为350kb,但可稳定遗传,无缺失、重组和嵌合现象。转化效率高（10*8-10*9转化子/μgDNA）。基因组DNA容易分离和制备。感染性克隆的构建方法(以伪狂犬病毒PrV为例)•重组质粒的构建.•重组质粒与病毒基因组的同源重组.•重组病毒的分离、纯化.•将含有伪狂犬病毒(PRV)基因组全长克隆的BAC载体转化E.coli重组缺陷型菌株DH10B.•含有PRV基因组全长克隆的BAC质粒转染真核细胞PK-15.•病变细胞中病毒的收获及鉴定.PrV感染性克隆的构建流程BAC病毒基因组DNAPK-15BACPK-15重组病毒基因组DNABAC重组病毒基因组DNADH10BBAC含有PRV基因组全长克隆的BAC质粒BAC含有PRV基因组全长克隆的BAC质粒BACPK-15病毒粒子提取基因组转染真核细胞细胞病变ULUsIRTRTK-/gG-/LacZ+PKgGLacZgGgDcatoriFrepEparAparBhomologyhomologyULUsIRTRBACBAC骨架TK-/gG-/BAC+提取环状基因组DNA转化DH10BULIRTRBAC提取BAC质粒DNA转染IBRS-2细胞PrV感染性克隆的构建流程图亲本株PrVTK-/gG-/lacZ+与含BAC骨架穿梭质粒同源重组ULIRUSTRPrVTK-/gG-/lacZ+gG11KIRPKgGgDgIgE28KTRlacZPstIBamHIPstIUsregionpSB301catparArepESphINotISphIoriSPstINotIKpnIparB重组病毒PrVTK-/gG-/BAC筛选IdentificationofPCRofcatgeneoftherecombinantvirusPrVTK-/gG-containingE.coliF-plasmidsequences.M.DL-2000marker;Lane1.pSB301;Lane2.PK-15cellcontrol;Lane3-24.virusesisolatedfromplaquepurified.重组病毒TK-/gG-/BAC+的鉴定重组病毒TK-/gG-/BAC+的PCR鉴定重组病毒TK-/gG-/BAC+的Southern杂交鉴定M123123PrVTK-/gG-/BAC在组织细胞中的生物学特性0.01.02.03.04.05.06.07.08.00122436486072TimeAfterInfection(Hours)MeanVirusTiter(log10)pEaBluePRV-BACSingle-stepgrowthcurvesoftheparentvirusPRVTK-/gG-/lacZ+andtherecombinantvirusPRVTK-/gG-/BACViruswasharvestedfromcellsat2、6、12、24、48and72hpostinfectionandtitersweredeterminedbyplaqueassayinPK-15cells.闭合环状的TK-/gG-/BAC基因组转化E.coliDH10B筛选IdentificationofPCRofcatgeneofpTKgGBACM.DL-2000marker;Lane1.pSB301;Lane2.PRVTK-/gG-/lacZ+;Lane3-14.DNAisolatedfrom12bacterialclones.PrV感染性克隆Southern杂交分析lanes1、2and3.TK-/gG-/lacZ+、TK-/gG-/BACandpTKgGBACdigestedwithNotI;lanes4、5and6.TK-/gG-/lacZ+、TK-/gG-/BACandpTKgGBACdigestedwithPstI.BamHI酶切提取的TK-/gG-/BAC+质粒1:GenomicDNAfrominfectedcells2:genomicDNAfrombacteria提取的PrVEaTK-/gG-/BAC+细菌质粒转染IBRS-2细胞BAC-CATPCR检测细胞病变BAC骨架质粒转染细胞TK-/gG-/BAC+质粒转染细胞F1代免疫动物技术路线PRV亲本株TK-/gG-/lacZ+(5×104PFU）PRV重组株TK-/gG-/BAC(5×104PFU）PRV的全长BACDNA（50ug)转移质粒pSB301（50ug)PK-15细胞(8只/组)(肌肉注射)3周后检测中和抗体(8只/组)(肌肉注射)3周后检测中和抗体PRVEa株攻毒(1×105PFU)(100ul/只)1周后检测中和抗体及保护率1周后检测中和抗体及保护率11.251.51.7522.252.5PRV-EaBluevirusPRV-BACvirusPRV-BACDNAMeanNeutralizationAntibodyTiters(log10)1dose2doses7dp.i.14dp.i.AsPrV-specificneutralizingantibodieswereundetectableafterimmunizationtwotimesinuninfectedcells-immunizedandtransferplasmid-immunizedmice,thetitersofneutralizingantibodiesofthesetwogroupsofmicewerenotindicated.PrV中和抗体检测02040608010002468101214Dayspost-challengeSurvival(%)UninfectedCellsPRV-EaBlueVirusPRV-BACVirusPlasmidpSB301PRV-BACDNAGroupsofmicewerechallengedi.m.withthevirulentPRV-Eastrain.PrV-BACDNA免疫的保护力DNA病毒感染性克隆技术的发展-定位重组系统的引入•定位重组系统是由单个多肽酶识别特定的DNA序列而发生重组的遗传操作系统。•研究较多的4种定位重组系统分别是噬菌体P1的Cre/l