大肠杆菌CRISPR-Cas9系统基因敲除简介

1CRISPR-Cas系统的研究进展CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)，即串联的、间隔的短回文重复序列，最早在1987年研究大肠杆菌的碱性磷酸酶基因时被发现[1]。随后在细菌和古细菌的基因组中也发现大量存在CRISPR，研究证实它能够保护自身抵御外来病毒和质粒的入侵[2]，作用机制是依靠crRNA(CRISPRRNA)和tracrRNA(trans-activatingcrRNA)结合并引导Cas蛋白对外源DNA进行特异性降解[3]。已发现的CRISPR-Cas系统有三种类型：Ⅰ型，Ⅱ型和Ⅲ型，其中以Ⅱ型最为简单，只需一种Cas蛋白，即通过RNA介导核心蛋白Cas9识别并切割靶序列，引起DNA双链断裂[2]。受自然界中CRISPR-Cas系统的启发，主要对来自于化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)的Ⅱ型CRISPR-Cas系统进行人为改造和利用，目前已经将其发展成为一种新型的基因编辑技术，实现基因敲除、插入、定点突变和组合编辑[4]，并成功应用于大肠杆菌、酿酒酵母、家蚕、果蝇和人类细胞等[5]。和传统的基因编辑技术相比，这一新技术具有成本低、操作简便、效率高的优点[6]。2CRISPR-Cas系统的组成与机制典型的Ⅱ型CRISPR-Cas系统基因座包含tracrRNA基因、Cas蛋白编码基因(cas9、cas1、cas2和csn2)、CRISPR基因座（引导序列、间隔序列和重复序列）这三个部分[6]。Ⅱ型CRISPR-Cas系统的作用机制可分为三个阶段，第一是高度可变间隔序列的获得（图1），第二是CRISPR-Cas系统基因座的表达，第三是对外源遗传物质的降解[6]（图2）。Cas1、Cas2和Csn2蛋白与新间隔序列的获得相关。与间隔序列同源的外源遗传物质上的原间隔序列(protospacer)，其下游存在一段保守序列，被称为PAM(protospaceradjacentmotifs)[7]。当外源噬菌体或质粒首次入侵时，宿主菌通过识别PAM，选取合适的原间隔序列，切割并整合到CRISPR基因座中，形成新的间隔序列。正常情况下CRISPR基因座的表达水平很低[8]，但是当外源噬菌体或质粒再次入侵时，CRISPR基因座的表达水平快速上调，首先转录形成前体crRNA(pre-crRNA)，随后在tracrRNA的指导下，由Cas9和核酸内切酶RNaseⅢ加工为含有一个间隔序列和部分重复序列的成熟crRNA。成熟的crRNA与tracrRNA形成crRNA:tracrRNA复合物，并结合Cas9形成核糖核蛋白复合物，crRNA上的间隔序列与外源DNA的原间隔序列互补配对，从而引导具有核酸内切酶活性的Cas9对DNA双链进行特异性切割。图1宿主菌获得新间隔序列的机制[6]Fig.1NewspcacerofCRISPRacquisition图2Ⅱ型CRISPR-Cas系统表达及降解外源遗传物质的机制[6]Fig.2SchematicofCRISPR/Cas9mediatedDNAdouble-strandbreak3双质粒CRISPR-Cas9基因敲除系统本实验中采用双质粒CRISPR-Cas9系统[5]对大肠杆菌进行“无痕”基因敲除，涉及到的两个质粒分别为pCas和pTargetF（图3）。该系统将crRNA:tracrRNA复合物融合为人工设计的sgRNA(singleguideRNA)（图4），省去了将pre-crRNA加工为成熟crRNA的步骤，只需设计长度为20nt，与靶序列互补的N20序列。pCas包含cas9基因及其原始启动子，将Cas9导向pTargetF的pMB1复制子的sgRNA-pMB1，提高编辑效率的λ-Red重组酶基因(gam、bet和exo)，卡那霉素抗性基因kanR和温敏复制子repA101。pTargetF包含sgRNA序列，N20序列，pMB1复制子和壮观霉素抗性基因aadA。首先向待敲除菌株中电转入pCas，通过L-阿拉伯糖(L-arabinose)诱导，使重组酶Gam、Bet和Exo表达。Gam能与RecBCD核酸外切酶结合，抑制其活性，防止对外源DNA的降解。Exo为核酸外切酶，可以结合在双链DNA末端，从5’向3’降解DNA单链，产生3’突出端。Bet能结合在3’突出端上，保护其不被降解，并介导DNA互补链的退火[9]。然后将外源DNA敲除片段和含有N20序列的pTargetF-X（X代表待敲除的目的基因）同时电转入宿主细胞。其中，外源DNA敲除片段由目的基因的上游同源臂和下游同源臂融合而成（图5）。设计引物时，对上游同源臂的反向引物和下游同源臂的正向引物进行修饰，使其能反向互补，第一步PCR将上下游同源臂片段分别扩增出来。第二步PCR将上下游同源臂片段共同作为模板，利用两者间存在反向互补序列，能在退火时形成一段重叠链并延伸，从而实现融合。pTargetF-X转录形成的sgRNA通过N20序列与目的基因的同源序列相互配对，引导与之结合的Cas9识别靶序列进行切割，形成DNA双链断裂。随后通过同源重组，依靠外源DNA敲除片段对断裂的DNA进行替换[10]，从而使目的基因缺失。对于宿主细胞中pTargetF的去除，向培养基中添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，诱导pCas转录形成sgRNA-pMB1，结合Cas9对pTargetF的pMB1复制子进行切割破坏。去除pTargetF而含有pCas的菌株可直接进行下一轮的敲除。对于无抗菌株的获得，将菌株于42℃下过夜培养，即可去除温敏质粒pCas。图3质粒pCas和pTargetF[22]Fig.3PlasmidpCasandpTargetF图4将crRNA:tracrRNA复合物融合为sgRNAFig.4ConstructionofsgRNA图5重叠PCR构建融合片段Fig.5ConstructionoffusedfragmentbyoverlapextensionPCR参考文献:[1]IshinoY,ShinagawaH,MakinoK,etal.Nucleotidesequenceoftheiapgene,responsibleforalkalinephosphataseisozymeconversioninEscherichiacoli,andidentificationofthegeneproduct[J].JournalofBacteriology,1987,169(12):5429-5433.[2]BrounsSJJ,JoreMM,LundgrenM,etal.SmallCRISPRRNAsguideantiviraldefenseinprokaryotes[J].Science,2008,321(5891):960-964.[3]李聪,曹文广.CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展[J].生物工程学报,2015,31(11):1531-1542.[4]刘妮,陆沁,刘娟,陈航.CRISPR/Cas系统最新研究进展[J].生物技术通报,2017,33(2):53-58.[5]JiangY,ChenB,DuanC,etal.MultigeneeditingintheEscherichiacoligenomeviatheCRISPR-Cas9system[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology,2015,81(7):2506-2514.[6]方锐,畅飞,孙照霖,李宁,孟庆勇.CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术[J].生物化学与生物物理进展,2013,40(8):691-702.[7]MojicaFJ,DíezVC,GarcíaMJ,etal.ShortmotifsequencesdeterminethetargetsoftheprokaryoticCRISPRdefencesystem[J].Microbiology,2009,155(3):733-740.[8]PougachK,SemenovaE,BogdanovaE,etal.Transcription,processingandfunctionofCRISPRcassettesinEscherichiacoli[J].MolecularMicrobiology,2010,77(6):1367-1379.[9]张全,高会杰,佟明友.Red重组技术研究进展[J].中国生物工程杂志,2006,26(1):81-86.[10]Hsu,Patrick,Nbsp,etal.DevelopmentandapplicationsofCRISPR-Cas9forgenomeengineering[J].Cell,2014,157(6):1262-1278.