透射电镜动、植物、细胞样品取材要求及方法(请正确取材、有效固定)

电镜样品取材的基本要求⑴快取材动作要迅速，材料离体后１min内就进入固定液，使组织、细胞尽可能保持原来生活状态，不要超过10min解剖器械要锋利(如新的手术刀、新的双面刀片)，避免牵拉和挤压，尽量减少取材中的机械损伤⑵准取材要准确①器官要准确；②部位要准确：如观察肾小球得取皮质而不要取到髓质胃肠道、皮肤和角膜、视网膜、耳蜗等要注意方向性（纵切or横切），取材取成条状，确保要观察的部位在切面方向。组织块的包埋方向与切面方向要十分清楚，尽量自己在包埋前进行定位（定向包埋，竖放or横放）⑶冷取材过程应在低温下（０～４℃）如冰块上操作，以降低酶的活性，减少细胞内结构的损伤。所用器械、容器、戊二醛等均需预冷。⑶小所取材料体积要小，一般不超过1mm3，使组织得到均匀而充分固定，肝等致密组织的取材尤其要小小肠等取材时要方向性可取成条状；部分可取较大面积但截面约1mmX1mm（厚度必须小于1mm）固定剂渗透力较弱（戊二醛为0.5mm，饿酸更弱），组织块太大则内部将得不到良好的固定而坏死注:脑、胰等柔软组织先切成较大厚片于戊二醛固定数分钟再切成小块置于新的戊二醛固定液小肠、周围神经、肌肉等方向性、易扭曲样本可绑在小波棒固定待硬化后纵向切成长方形固定及时、正确的固定不但使细胞超微结构尽量接近其生活时的状态，也为后续的标本制备做作准备固定不当，不但使细胞形态发生改变，对后续的包埋、切片及染色造成困难，甚至导致试验的失败生物组织的取材1、浸入固定：麻醉（1%戊巴比妥钠按5ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一小块组织，放入预冷2.5%戊二醛固定液待组织稍硬后用新的、无油污锋利的（双面）刀片将材料切成大约1mm宽，2～3mm长的小块，再将其切成１mm3的小块，取材要尽量快速准确。如果有方向要求，如一些空腔器官、皮肤、角膜等，要注意方向性，保证需要观察的部位准确取到。最后用牙签将这些小块逐一放入盛有冷的新鲜固定液的有盖青霉素小瓶（或离心管）里，放入冰箱冷藏室低温固定（４℃）过夜。2、有时需灌注固定，如取脑部组织培养细胞的取材贴壁细胞：先倒出培养液，采用胰蛋白酶消化或用细胞刮（会产生碎屑）刮下。而后带培养液进行离心（1000～1500rpm）10min左右。离心完毕倒出培养液，管底的细胞团不要打散，沿管壁缓慢倒入适量的（一般为材料体积的5～10倍）2.5～3%戊二醛固定液，固定约1h，也可在4℃冰箱固定过夜。悬浮细胞固定：1、离心固定：参考贴壁细胞离心步骤2、琼脂预包埋法：固定液固定的细胞悬液离心，弃上清后在50℃水浴中将细胞团加热，用热的吸管吸一滴已加热融化并冷却至50℃的琼脂，滴入细胞团中，使细胞悬浮。为避免琼脂凝固，将细胞放入保温的离心管，在3000-5000rpm离心1min。在离心管置于水浴条件下，加入70%乙醇，停留1h。当细胞团被琼脂包埋后，取出切成小块，用常规方法进行双重固定（先戊二醛再饿酸固定）。植物组织的取材植物组织取材较容易，植物细胞离体后变化不像动物细胞那样迅速，但植物细胞的细胞壁阻碍着固定液的迅速渗透。因此，植物材料的取材宜切成薄片状，经适当固定后再切成小方块。植物材料内部存有的空气会使其漂浮于固定液液面上而影响固定效果，需抽取出气体抽取气体：将植物组织同固定液一起倒入注射器，用戴有乳胶套食指堵住注射器出口，右手拉动针栓；将注射器口垂直向上，松开食指，右手轻推针栓使液面上的气泡从注射器口排出。反复多次，直至组织沉入固定液。