人IFN检测试剂盒ELISPOT法说明书

1/4人IFN-检测试剂盒（ELISPOT法）说明书【产品名称】人IFN-检测试剂盒（ELISPOT法）【包装规格】96T/盒【预期用途】本试剂仅供科研使用，不适合用于临床检测。用于测定特定细胞样本中（例如PBMCs）分泌IFN-的细胞比例，从而测定细胞对于特定抗原的免疫响应。【IFN-简介】20世纪30年代，许多病毒学家在研究两种病毒感染同一宿主细胞时，发现普遍存在两种病毒相互拮抗的现象，由此产生了病毒间干扰现象的概念。1957年发现细胞与病毒一起培养后能产生一种可溶性因子，该因子能“干扰”病毒感染新的细胞，此因子被称为“干扰素”。此后证明干扰素（interferon，IFN）是由一族分泌蛋白质组成，对同种病毒具有广谱抗病毒活性，它存在于各种脊椎动物体内，平时细胞内含量很低，经病毒或其它干扰素诱导剂诱导后产量可以提高。IFN蛋白家族基于它们的基因序列、染色体定位和受体特异性分为3型，即I型、II型和III型干扰素。I型包括IFN-、、、、、、、等；II型干扰素由单基因家族IFN-构成，又称为免疫干扰素；III型干扰素是一种新发现的细胞因子，与I型干扰素关系密切，称为IFN-。-干扰素主要是由抗原、有丝分裂素等刺激、活化的CD4+Th1、CD8+T细胞及NK细胞所分泌的一类可溶性糖蛋白。抗原、T细胞促分裂素（PHA、ConA）、细胞因子（IL-2、IL-12、IL-18、bFGF、PDGF、EGF）、葡萄球菌肠毒素B，均会诱导-干扰素的合成。【检验原理】机体被外来的病原感染后，会产生一系列的免疫应答反应，其中重要的一条免疫途径是细胞免疫。机体内的T细胞受到抗原的刺激致敏，产生效应T淋巴细胞，当这些T细胞再次受到相同抗原刺激时，会发生特异性免疫反应，分泌多种细胞因子如γ-干扰素。经适当分离、处理的细胞（如PBMCs）与相应刺激免疫原一起加入到预包被抗γ-干扰素抗体的PVDF膜微孔中，培养一段时间。若细胞被激活开始分泌γ-干扰素，局部（在紧靠分泌细胞的周围）分泌出的γ-干扰素会被PVDF薄膜上特异抗体捕获。被捕获的γ-干扰素可进一步与辣根过氧化物酶偶联的抗γ-干扰素抗体特异性结合并使其滞留在PVDF薄膜表面，最后通过显色底物使其在反应部位形成不溶性斑点，每一个斑点代表一个分泌γ-干扰素的细胞，记数斑点数量可以获得被激活细胞的数量。并通过与总细胞数的比值，可以进一步计算在被激活细胞的频率。2/4【主要组成成分】1、试剂盒组分序号组分名称规格数量主要成分1预包被细胞培养微孔板（人IFN-抗体）96孔1块由12×8孔的可拆卸板条组成，已包被鼠抗人IFN-单克隆抗体2阴性质控1mL2瓶无抗原的基质液3阳性质控1mL2瓶主要成分为植物凝集素PHA4酶标液（人IFN-）12mL1瓶含有HRP标记的鼠抗人IFN-单克隆抗体5浓缩洗涤液（10×）30mL1瓶主要成分为磷酸盐缓冲液6AEC显色液A0.6mL1瓶含过氧化氢7AEC显色液B12mL1瓶含3-氨基-9-乙基咔唑8说明书/1份/注：不同批号试剂盒中各组分不能互换2、需要实验者自行准备的试剂与仪器•水平离心机（温控18~25℃，离心力不低于1800g）•II级生物安全柜或超净工作台•细胞计数设备：显微镜手工计数或自动血细胞计数仪计数•CO2细胞培养箱•微量移液器及配套加样枪头•1.5mLEP管、15mL离心管•ELISPOT读板仪或体式显微镜、放大镜【储存条件及有效期】•试剂未启用于2~8℃：避光密封保存，有效期12个月。•试剂启用后于2~8℃：有效期14天。•生产日期：见标签。•有效期至：见标签。【操作步骤】注意：各试剂和板条使用前需室温平衡至少半小时，以便温度恢复至室温。1、每个测试样本需3孔（阴性对照（N）、检测孔（T）、阳性对照（P））或按照使用者实验安排。阴性对照（N）：每孔加入50μL阴性质控溶液。检测孔（T）：每孔加入50μL使用者待测的刺激物溶液。3/4阳性对照（P）：每孔加入50μL阳性质控溶液。之后，以PBMCs为例，建议每个检测孔加入100μL细胞浓度为2.5×106cell/mL的细胞悬液。其它种类细胞可以按使用者的实验计划进行。2、当加完所有的样品之后，盖上板盖，放入37℃，5%CO2培养箱，培养16~20小时。3、洗涤液：根据所需量，将10×浓缩洗涤液用蒸馏水稀释10倍，即为洗涤液。4、洗板：从培养箱取出培养板，倾倒孔内液体，洗涤液200μL/孔洗涤5次，每次30秒，最后一次，在吸水纸上扣干。5、酶标液孵育：每孔加入100μL酶标液，室温(18~30℃)孵育1hr。6、洗板：倾倒孔内液体，洗涤液200μL/孔洗涤5次，每次30秒，最后一次，在吸水纸上扣干。建议优化步骤（可省略）：打开微孔板背面保护壳，洗PVDF膜反面一次可有效降低最终显色的背景。7、显色：根据需要量，将AEC显色液A和AEC显色液B以1:19的体积比混匀后即为AEC显色液工作液（配好的AEC显色液工作液避光保存于2~8℃半小时内有效，使用时现配现用）。每孔加入100μL的显色液，室温避光静置显色15~45分钟（在18~25℃，显色25分钟较合适）。8、待斑点生长到适合的大小后，倾倒孔内液体，去离子水洗涤2遍，彻底终止显色反应。将板倒扣在吸水纸上，拍干，之后取下保护层，放于通风处，让膜自然晾干。9、ELISPOT板斑点计数，做统计分析。实验结果示意图【结果判断】1、通常正常结果，阴性质控（N）对照孔斑点数≤20，而阳性质（P）控对照孔的斑点遍布整个孔。2、阴性质控（N）对照孔斑点数超过20个时，使用者有必要确认所用细胞是否处于自发分泌IFN-状态。3、阳性质控（P）对照孔斑点数应当超过20个。当阳性质控（P）对照孔斑点数少于20个或颜色很浅时，使用者需确认细胞是否在试验过程中已失活。根据个体差异，少数人的免疫细胞对PHA不敏感，所以，如果测试孔（T）能够正常产生斑点，可以忽略阳性质控（P）4/4对照孔斑点过少的现象。注：阳性质控在设计上的主要原理是通过CD3分子刺激T细胞，若使用者的细胞并非PBMCs或者T细胞，则需要先确认所用细胞是否能被CD3信号通路激活，否则并不适用本试剂盒所配阳性质控。使用者也可以根据需要自行确定合适的阳性质控。【性能】1、精密度：斑点数≥100个时，批内差异≤15%，批间差异≤15%。2、特异性：与人源IL-2、IL-18、IL-4、IL-21、IL-23、IFN-ω、IFN-α-2a、IFN-α-2b、TNF-α无明显交叉反应。【注意事项】1、使用前仔细阅读说明书，不同试剂盒批号的试剂不能混用。2、细胞孵育结束前注意无菌操作，避免试剂、PVDF微孔、细胞悬液和细胞培养液的污染。不用的板条应在超净工作台中拆下装入铝箔袋中，密封放回2~8℃保存。3、移液器吸头或自动洗板器请不要接触到微孔板内PVDF膜。吸头或洗板机造成的压痕或缺口会产生假象斑点。4、在细胞培养过程中，任何移动、震动（包括开关培养箱门）都会导致细胞在培养板上的移动，从而得到不规则斑点或者斑点花斑。保持培养板的静置。5、当操作人源性样本时应当注意，所有血液样本都有潜在的感染危险。处理、使用、储存和放置血液样本和试验组分时，应遵守当地的国家生物安全指导指南或规章。6、浓缩洗涤液（10×或20×）在储存期间可能会有结晶析出，属于正常现象。使用前可在水浴中加温（如37℃）助溶，使结晶完全溶解后再进行稀释。对洗涤效果不会产生影响。7、AEC显色底物溶液对眼睛、呼吸系统和皮肤有刺激，注意避免呼吸吸入、皮肤接触。化学试剂都有潜在危害，操作时佩戴合适的手套、口罩，必要时使用合适的防护服。【问题分析与解决】问题可能原因解决办法背景高洗涤不充分显色前拿下背板，冲洗孔膜背面一次，以防部分试剂漏出后导致背景高PVDF膜没有充分干燥将膜充分干燥；在读板前将板子放在4度过夜有利于斑点和背景分开，降低背景显色显色时间过长实时观察显色过程，适时终止显色反应孔中出现空白区域膜被破坏枪头不要触及板膜，不建议使用洗板机操作过程中出现干膜确保检测过程中膜不出现干燥现象细胞分布不均匀将细胞混匀后再加入孔中孔中有片状花斑膜上有残留细胞残存刺激后充分洗涤，确保没有细胞粘附在膜上斑点聚集，分界不清细胞聚集了，斑点拖尾在培养过程中禁止移动培养板