基于电子捕获裂解电子转运裂解串联质谱技术的蛋白质组学研究

基于电子捕获裂解/电子转运裂解串联质谱技术的蛋白质组学研究*孙瑞祥1)**董梦秋2)**迟浩1)杨兵2)秀丽蕴1)王乐珩1)付岩1)贺思敏1)(1)中国科学院计算技术研究所，智能信息处理重点实验室，北京100190；2)北京生命科学研究所，北京102206)摘要蛋白质组学的兴起带动了质谱技术的快速发展，而质谱技术的进步则拓宽了蛋白质组学研究问题的广度．最近10年内，肽段或完整蛋白质在质谱仪中的裂解技术———电子捕获裂解(electroncapturedissociation,ECD)与电子转运裂解(electrontransferdissociation,ETD)逐渐发展起来．ECD和ETD在蛋白质组学中的应用，特别是在蛋白质的翻译后修饰鉴定和“自顶而下(Top-down)”的完整蛋白质裂解研究中已经展示出了诱人的前景．对ECD和ETD的基本原理、质谱特点、仪器实现、数据解析算法与软件开发，以及在蛋白质组学中的应用进展等方面进行了比较系统全面的阐述，并对当前的研究问题、面临的技术挑战与未来的发展趋势等方面作了深入剖析．关键词电子捕获裂解，电子转运裂解，碰撞诱导裂解，串联质谱技术，计算蛋白质组学学科分类号Q51，TP39DOI:10.3724/SP.J.1206.2009.00352*国家高技术研究发展计划(863)(2008AA02Z309,2007AA02Z315,2007AA02Z1A7),国家重点基础研究发展计划(973)(2010CB912701)和中国科学院知识创新计划(KGGX1-YW-13)资助项目.**通讯联系人.Tel:[phone]孙瑞祥.E-mail:[e-mail]董梦秋.E-mail:[e-mail]收稿日期：2009-06-05，接受日期：2009-09-04生物化学与生物物理进展ProgressinBiochemistryandBiophysics2010,37(1):94~102www.pibb.ac.cn质谱技术已经成为当前蛋白质组学研究中不可或缺的平台，质谱数据的信息质量直接决定了蛋白质鉴定的可靠性和鉴定数量．目前，蛋白质鉴定最主要的方法是利用串联质谱检索蛋白质序列数据库[1]．虽然它可以较好地解决大部分简单或中低复杂程度的蛋白质鉴定问题，但随着人们对复杂的蛋白质翻译后修饰鉴定需求的提高，由碰撞诱导裂解(collisioninduceddissociation,CID)方式获得的串联质谱在鉴定翻译后修饰问题上遇到了很多技术困难，如由于显著的中性丢失而导致质谱中与氨基酸序列相关的离子信息减少、难以确定修饰位点等．1998年发现的电子捕获裂解(electroncapturedissociation,ECD)[2]和2004年发现的电子转运裂解(electrontransferdissociation,ETD)[3]可以很好地解决这个问题．这两项质谱新技术的应用为蛋白质组学的发展带来了新的曙光，基于电子的碎裂技术的时代已经到来．本文对ECD和ETD技术分别从基本原理、质谱特点、仪器开发、基础研究进展、数据处理算法与软件开发等方面进行了详细的阐述，并对当前的研究问题和未来的发展趋势进行了综合分析．1基于电子的碎裂技术简介在当前的蛋白质鉴定中，CID是最常用的肽段碎裂技术，CID常应用于采用胰蛋白酶(trypsin)酶切、在质谱仪中离子化的肽段．肽碎裂过程主要产生b和y类型的离子，如图1所示[1]．相应地，常用的蛋白质鉴定软件也主要是利用这两种类型的离子峰信息与理论质谱进行匹配，可靠的匹配结果一般依赖于匹配上较多的强度较高的连续谱峰．CID在蛋白质鉴定中已经有很多成功的应用，但随着蛋白质组学研究的逐渐深入，人们对肽段或蛋白质的碎裂提出了更多更高的要求．如对于非胰蛋白酶酶切的较长肽段，或者发生翻译后修饰的肽段，CID的碎裂途径往往受到很大的抑制，导致产生的质谱有用信息相对于未修饰的肽段减少，使得鉴定结果的可靠性显著降低．因此，寻求新的更有效的碎裂方法最近几年已成为蛋白质质谱领域的一个重要研究方向．1998年，McLafferty等[2]意外发现了蛋白质电子捕获碎裂的现象，进而应用到蛋白质鉴定领域[2,4]，这标志着蛋白质基于电子的碎裂技术时代的孙瑞祥等：基于电子捕获裂解/电子转运裂解串联质谱技术的蛋白质组学研究2010;37(1)开始．与CID基于碰撞能量再分配的基本机理完全不同，ECD一般是通过低能量的自由电子与质子化的多电荷蛋白质或肽离子，在相互作用的过程中由于放热而瞬间产生碎裂，它是一个非各态历经(nonergodic)的过程，主要产生由N—C琢键的断裂而形成的c和z类型离子(图1)．由于要同时容纳多电荷蛋白质或肽离子与自由电子在离子阱质谱仪中技术上所面临的困难，ECD从产生开始就主要应用在傅立叶变换质谱仪(fouriertransformmassspectrometer,FTMS)上[5]．由于FTMS仪器价格昂贵、运行维护成本高等因素，ECD的应用仅局限于拥有FTMS仪器的少数实验室中，ECD在蛋白质组学中的应用受到了仪器方面的限制，并没有获得广泛的开展．针对ECD在FTMS上应用的局限性，Hunt等受ECD的启发，于2004年发现，通过携带一个电子的阴离子(anion)与肽阳离子(cation)相互作用，也可以产生类似ECD的碎裂行为，他们称之为“电子转运裂解”(electrontransferdissociation,ETD)，进而，他们通过改进已有的线性离子阱(lineariontrap)质谱仪，在原有仪器的后端添加了通过化学离子化的方法引入携带电子的阴离子，然后与肽阳离子在离子阱中相互作用而产生碎裂，发明了一套完整的ETD技术[3]．由于线性离子阱质谱仪具有高灵敏性、快速扫描特点和仪器的性价比较高等优势，它已在蛋白质组学实验室中被广泛采用，因此ETD技术的发明使得基于电子的碎裂方式在蛋白质组学研究领域中有了更广泛的用武之地，为下一代蛋白质组学的发展带来了新的“曙光”，基于电子的碎裂方式开始在蛋白质组学领域中获得广泛的应用．除了ECD和ETD以外，其他基于电子的碎裂技术还有电子分离裂解(electrondetachmentdissociation)[6]，电子激励裂解(electronicexcitationdissociation)[7]等．相对于ECD和ETD，这些技术当前在蛋白质组学中的应用还很少．考察一项新技术的影响，还可以通过检索发表的论文．图2是PubMed上发表的以ECD或ETD为研究内容的论文数量随年度的变化关系．查询时间段为：ECD(1998-01-01～2009-04-15)，ETD(2004-01-01～2009-04-15)．查询内容为论文题目或摘要中含有“electroncapturedissociation”或“electrontransferdissociation”．从图2中可看出，以研究ECD或ETD为内容的论文数量最近几年出现了较快的增长趋势，特别是2009年，仅三个半月时间，发表ETD方面的论文数量就已经超过了2008年全年的总数．2ECD/ETD串联质谱的特点ECD或ETD是电子与带多电荷的肽段或蛋白质阳离子进行相互反应的过程中而产生碎裂的，电子在碎裂过程中起到了至关重要的核心作用，它们之间的主要差别是ECD的电子是自由电子，而ETD中的电子是通过小分子的阴离子提供的．ECD与ETD的碎裂机理是类似的，目前还基本没有报道它们之间有什么显著的差异，但与CID的碎裂机理却迥然不同，CID主要是基于碰撞能量再分配的原理，结合能小的键容易断裂，在时间尺度上比ECD/ETD要慢，因此通常也称为“慢热”(slow-heating)碎裂．碎裂机理上的不同导致了ECD/ETD与CID串联质谱的行为特征上存在着很大的差异．2.1离子类型的差异CID主要断裂肽键，产生以b和y类型为主的离子峰，而ECD/ETD则主要碎裂N—C琢键，产生以c和z类型为主的离子峰．如图3a和3b分别为Fig.1Cleavagesitesofthepeptidebonds图1肽链碎裂点示意图HCNHHR1a1x3b1y3c1z3a2x2b2y2c2z2a3x1b3y1c3z1CHR2CHR3CHR4COCOCOCONHNHNHOH+2H+2H+2H+2H+2H年份5010152025303540451998119991200020012002200320042005200620072008200937121425223633396142727293822Fig.2PublicationsofECDandETDonPubMed图2PubMed上检索到的ECD和ETD发表论文数量与年度的关系:ECD;:ETD.95··生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys.2010;37(1)Fig.3ExampleofCIDandETDspectra图3CID与ETD质谱特点的比较(a)带2个电荷肽段LIDDNNLNTAGEGGCYPR的CID质谱.(b)带2个电荷肽段LIDDNNLNTAGEGGCYPR的ETD质谱.(c)带3个电荷肽段IGENKDAMDGWFR的CID质谱.(d)带3个电荷肽段IGENKDAMDGWFR的ETD质谱.100203040506070809010040050060070080090010001100120013001400150016001700m/z(a)LIDDy16y15y14NNy13y12Ly11Nb4b6b7b8y10TAy9b10y8Gb12y6Gb15y3YEy7Gy5Cy4PRb16b5b11(b)1040050060070080090010001100120013001400150016001700m/z18001900200023456LIDDz16z15z14NNz13z12Lz11Nz10TAz9z8Gz6Gz3YEz7GCPRc17z17(c)1002030405060708090100500600200300400m/z700800Iy12Gy11Eb2y10NKy6Mb11y3FAGy5Wy4Rb12DDy2b7b8b9(d)0500600300400m/z700800900100011001200130014001500100908070605040302010Iz12Gz11Ez10NKMz3FAGz5Wz4RDDz2z7z8z9c3c4c5c6c7c8c9c10c11c12z696··孙瑞祥等：基于电子捕获裂解/电子转运裂解串联质谱技术的蛋白质组学研究2010;37(1)圆.3侧链丢失的差异在CID谱中，经常观测到碎片离子失水或失氨的情况，而在ECD/ETD中则不典型，很少出现，但ECD/ETD的母离子携带电子后导致电荷减少，经常出现完整肽段的侧链丢失情况，如图3b,d和图4b中的右侧未标注系列高峰簇就对应于母离子(带电子)的侧链小分子丢失系列峰．此外，在ECD中，随着电子能量的增加，由侧链断裂而生成的离子，如w离子出现的机会增多．Fig.4DifferencebetweenCIDandETDspectra图4CID和ETD的碎裂特征比较(a)CID.(b)ETD.带2个电荷的肽段LIDDNNLNTAGEGGCYPR的CID谱和ETD谱，对于用胰蛋白酶酶切的带2个电荷肽段的多数ETD谱，由于仅在肽段的C端出现碱性的赖氨酸K或精氨酸R，ETD谱中z离子要远远多于c离子，但在出现遗漏酶切或者肽段含有组氨酸的情况下，则c离子的出现会相对增多．图3c和3d分别是带3个电荷肽段IGENKD-AMDGWFR的CID谱和ETD谱，带3个电荷的肽段中除C端的氨基酸外，一般还会含有另外的碱性氨基酸，c离子的出现机会增多．另外，还有少量的a和y类型的离子．圆.2与氨基酸序列依赖关系的差异CID在某些氨基酸组成的断裂点上常表现出断裂的倾向性，如脯氨酸P的N端断裂容易产生