口腔细胞培养及其应用精讲

人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版（本章所附照片除特别标注外均来自首医口腔基因治疗与牙再生分子生物学实验室）第六章口腔细胞培养及其应用人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版提要：本章介绍细胞培养的基本原理及基本方法；牙齿相关细胞、唾液腺细胞、口腔黏膜细胞、颌骨相关硬组织细胞、口腔肿瘤细胞的培养及特点；组织工程的基本原理、口腔组织特有的干细胞、再生医学技术在口腔医学中的应用；基因芯片、蛋白芯片、组织芯片，蛋白质组学、生物信息学、模式生物学、系统生物学等。重点掌握细胞培养基本原理及方法，口腔医学中相关细胞培养及其特点，了解口腔干细胞培养在口腔再生医学中的应用及口腔生物学其他研究方法。人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版第一节细胞培养人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版一、细胞培养的基本原理第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版细胞培养的基本概念细胞培养：模拟体内的生理环境，在适当的条件下，使活体组织细胞在体外环境存活、生长增殖，并维持其结构功能原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养传代培养：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版体外细胞生物学形态特点贴壁型细胞悬浮型细胞生长增殖过程培养细胞生命期培养细胞一代生存期第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版贴壁型细胞必须贴附于支持物表面才能生长。大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型：上皮型成纤维型游走型多形型第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版悬浮型细胞于悬浮状态下即可生长不需要贴附于支持物表面多见于血液淋巴细胞第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版几种常见细胞的形态原代培养神经元细胞（×10）原代培养星形细胞（×10）神经细胞瘤细胞系（×10）N20Y结肠癌细胞系（×10）Caco-2第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版培养细胞生命期所谓培养细胞生命期，指细胞在培养中持续增殖和生长的时间细胞全部生存过程大致分为以下三个阶段：原代培养期传代期衰退期第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版原代培养期：也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1～4周传代期：初代培养细胞一经传代后便改称为细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，成为无限细胞系无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。可能恶性变细胞永生性和恶性性非同一性状第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版培养细胞一代生存期所谓细胞“一代”，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，细胞传代后，一般要经过以下三个阶段:潜伏期（游离期，贴壁期）对数生长期停滞期（平台期）第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版培养细胞一代生存期第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版细胞生长过程中的重要现象接触抑制：由于细胞的相互接触而抑制细胞运动密度抑制：细胞因营养的枯竭和代谢物的影响而停止生长第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版培养细胞的体外生长环境无污染环境基质气体环境和氢离子浓度液相环境温度渗透压第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版无污染环境：高压蒸汽消毒器电热干燥箱滤器超净工作台紫外灯第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版基质：玻璃基质塑料饲养细胞，又称滋养细胞生物性基质处理培养表面金属第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版气体环境和氢离子浓度：5%二氧化碳95%空气pH为7.2～7.4第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版液相环境：水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐液：Hanks液、PBS、Earle液等天然培养基合成培养基无血清培养基第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版温度维持：（36.5±0.5）℃渗透压：290～320mOsm/kg第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版细胞培养常见仪器超净工作台细胞培养箱倒置相差显微镜第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版二、细胞培养的基本方法第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版无菌操作中的注意事项对实验中可能用到的器具及培养用液进行严格消毒灭菌培养室的消毒：培养室和超净台要用紫外灯和酒精严格消毒进入无菌室前要按照外科手术无菌要求进行洗手与着装培养过程中要注意无菌操作：时刻铭记无菌物品与有菌物品要分开处理第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版ABA超净工作台中的实验用品要摆放整齐B实验前75%酒精喷洗双手无菌操作技术第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版CD开启封闭瓶口等操作应在火焰就近的地方，并轻轻灼烧CD第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版EFEF移液操作第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版基本培养操作技术培养细胞的取材与分离体外培养细胞的纯化细胞的冻存与复苏第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版培养细胞的取材与分离取材部位准确严格无菌操作尽快培养减小损伤制备标本第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版体外细胞的纯化人工纯化：酶消化法、机械刮除法、反复贴壁法、克隆法、培养基限定法、流式细胞仪分离法等自然纯化第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版细胞冻存要点：冷冻过程要缓慢冻存细胞必须处在对数生长期细胞复苏要点：快速解冻解冻后的细胞应离心去除冷冻保护剂后再接种到培养基中第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版细胞培养的污染、检测与控制微生物污染：细菌，真菌，支原体等污染化学污染：指影响细胞生存的非细胞所需物质混入培养物中，应在操作中防止细胞交叉污染：指目的细胞中混入其他种细胞，预防方法主要是严格按照规定操作，做好标记，避免发生混乱第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版微生物污染：污染的途径：空气、器材、操作、试剂、组织标本微生物污染的检测微生物污染的控制：抗生素除菌法；加温处理第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版FLcellpollutedbyStaphylococcusFLcellpollutedbyG+Bacteria首都医科大学细胞生物学系张海燕提供第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版FLcellpollutedbyescherichiacoliFLcellpollutedbymoldfungus首都医科大学细胞生物学系张海燕提供第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版细胞培养常用方法：组织块培养法酶消化法第一节细胞培养的基本原理人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版第二节口腔医学中相关细胞培养及其特点人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版一、牙齿相关细胞第二节口腔医学中相关细胞培养及其特点人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版牙周膜细胞培养方法：组织块法；酶消化法细胞形态特点免疫组织化学染色体外培养细胞的生长增殖特点功能特点牙周膜细胞增殖分化的影响因素第二节口腔医学中相关细胞培养及其特点人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版细胞形态特点原代人牙周膜成纤维细胞（×10）第3代人牙周膜成纤维细胞（×10）第二节口腔医学中相关细胞培养及其特点人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版免疫组织化学染色波形丝蛋白染色阳性（×10）角蛋白染色阴性（×10）第二节口腔医学中相关细胞培养及其特点人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版体外培养细胞特点：成功率高于牙髓细胞，达40%～80%可在体外长时间存活达4～12个月可持续传40代以上第二节口腔医学中相关细胞培养及其特点人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版功能特点分泌功能矿化功能收缩功能再生功能根面吸附等第二节口腔医学中相关细胞培养及其特点人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版牙周膜细胞增殖分化的影响因素生长因子胰岛素纤维黏连蛋白抗坏血酸羟基磷灰石第二节口腔医学中相关细胞培养及其特点人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版牙髓细胞培养方法：酶消化法；组织块培养法细胞形态特点：成纤维细胞型（与牙周膜细胞类似）免疫组织化学染色：波形丝蛋白（+）；角蛋白（-）体外培养细胞的生长增殖特点功能特点第二节口腔医学中相关细胞培养及其特点人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版生长增殖特点生长增殖较快可传代至第15～20代长时间体外培养可呈复层生长第二节口腔医学中相关细胞培养及其特点人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版功能特点碱性磷酸酶活性矿化现象对钙调节因子的反应对细胞因子的反应对氢氧化钙、羟基磷灰石盖髓剂的反应第二节口腔医学中相关细胞培养及其特点人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版二、唾液腺细胞第二节口腔医学中相关细胞培养及其特点人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版唾液腺细胞形态特点免疫组织化学特点功能特点唾液腺细胞的增殖与分化调节唾液腺细胞增殖、分化和功能的因素第二节口腔医学中相关细胞培养及其特点人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版细胞形态特点腺泡上皮细胞：体外培养的腺泡细胞多呈“铺路石”样排列导管上皮细胞：导管上皮细胞呈多边形肌上皮细胞：肌上皮细胞呈梭形或星形第二节口腔医学中相关细胞培养及其特点人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版导管上皮细胞（HSG细胞系）HSG细胞系（×4）HSG细胞系（×10）第二节口腔医学中相关细胞培养及其特点人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版A小型猪腮腺上皮细胞原代培养（×10）B小型猪腮腺上皮细胞alpha淀粉酶免疫组化染色（×10）腺泡细胞上皮细胞第二节口腔医学中相关细胞培养及其特点人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版免疫组织化学染色腺泡上皮细胞：角蛋白、淀粉酶、对氨基水杨酸、导管上皮膜、前角蛋白、单克隆角蛋白、分泌成分阳性反应导管上皮细胞：角蛋白、上皮膜蛋白、磷酸酐酶抗体染色阳性反应肌上皮细胞：肌动蛋白、S-100蛋白、肌凝蛋白抗体染色阳性反应第二节口腔医学中相关细胞培养及其特点人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版功能特点：分泌腺泡细胞：淀粉酶、PRP、唾液过氧化物酶、特异蛋白等腺泡上皮细胞：顶端分泌、基底及侧膜分泌导管细胞：胶原肌上皮细胞：胶原第二节口腔医学中相关细胞培养及其特点人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版唾液腺细胞的增殖分化基底潜能干细胞理论单细胞全能干细胞理论双细胞亚全能干细胞理论第二节口腔医学中相关细胞培养及其特点人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版调节唾液腺细胞增殖、分化和功能的因素细胞因子激素细胞外基质钙离子第二节口腔医学中相关细胞培养及其特点人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版三、口腔黏膜细胞第二节口腔医学中相关细胞培养及其特点人民卫生出版社——《口腔生物学》第四版口腔黏膜细胞培养方法：组织块法和酶消化法形态特点：卵圆形、多边形