[诊断学]溶血贫血

溶血性贫血常用的实验室检查(hemolyticanemiaHA)一、定义(definition)RBC寿命缩短、破坏过多或加速，超过骨髓造血代偿能力引起的贫血。(正常骨髓有6-8倍的代偿能力)骨髓代偿未引起贫血—溶血性疾病二、分类(classifition)（一）按病因分类•先天遗传性—红细胞内在缺陷•后天获得性—红细胞外在因素（免疫与非免疫）(二)按溶血发生部位分（RBC破坏场所）血管内溶血：急性溶血红细胞破坏（血循环中）游离血红蛋白↑结合珠蛋白↓血红蛋白尿含铁血黄素尿高铁血红蛋白白蛋白血红蛋白尿含铁血黄素尿返回Hb尿含铁血黄素尿freeHb(a2b2tetramers)HbdimersHpHp-Hbcomplex肾脏肝高铁Hbbindstohemopexin&albuminferriheme(Fe3+)globin血管外溶血：慢性溶血•红细胞•破坏（脾脏）•血红素珠蛋白卟啉铁游离胆红素↑尿胆原↑粪胆原↑三、实验室检查(laboratoryfeatures)（一）溶血性贫血的筛查检测1.有关红细胞破坏增加的检查（1）血浆游离Hb测定（敏感）•正常值：50mg/L•意义:血管内溶血时明显增加（60~650mg/L）（2）血清结合珠蛋白测定（Hp）•正常值：0.7~1.5g/L•溶血存在时，Hp减少。（3）RBC寿命测定•正常值：25~32天•51Cr同位素标记，半衰期15天，说明有溶血存在。（4）Hb尿测定（5）尿含铁血黄素试验（Roustest)（六）血浆高铁血红素清蛋白检测：正常人：阴性阳性：严重血管内溶血。生化法—光谱仪观察在558nm处有一吸收光带电泳法—出现一条高铁血红素清蛋白带2.红细胞代偿性增生的检查•血象见图•网织红细胞计数（无特异性）正常：0.5~1.5%,绝对值（24~84）×109/L溶贫时达5~25%甚至75%以上。•骨髓象见图Cabot’sring多色性红细胞Howell-Jollybody嗜碱点彩红细胞返回骨髓象（二）红细胞膜缺陷性的检测•细胞变球形，体表面积和内容物相等,易破坏•膜离子通道异常，钠内流增加。•红细胞膜上的蛋白（膜蛋白带Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ1、Ⅳ2、收缩蛋白、骨架蛋白、功能蛋白）的数量或结构发生变化，出现形态和功能异常，发生溶血性贫血。•遗传缺陷—遗传性球形、椭圆形、口形红细胞增多症。细胞在脾脏清除，属于血管外溶血。•后天获得性红细胞膜缺陷—阵发性睡眠性血红蛋白尿,膜上糖化肌醇磷脂（GPI）锚连蛋白异常。为慢性血管内溶血。膜脂质丢失=变形能力下降=脾清除率增加NormalHereditaryspherocytosis细胞膜细胞骨架红细胞膜缺陷的检验红细胞渗透脆性试验RBC孵育渗透性试验自身溶血试验及纠正试验(1)RBC渗透脆性试验检测红细胞对不同浓度低渗盐溶液的抵抗力等体积的血液加入一系列的低渗NaCl溶液中;达到平衡;高速离心并测定光密度.大多数正常RBC在NaCl浓度约0.50%时开始结构破坏.当盐浓度进一步降低渗漏和溶血增加.正常渗透脆性HS时低渗溶液中的异常溶血参考值开始溶血：0.42%~0.46%（4.2~4.6g/L）NaCI完全溶血：0.28%~0.34%（2.8~3.4g/L）NaCI临床意义开始溶血＞0.50％、完全溶血＞0.38％为脆性增高（1）脆性增高遗传性球形红细胞增多症（2）脆性减低小细胞低色素性贫血：海洋性贫血、缺铁性贫血(2)红细胞孵育渗透脆性试验原理37℃孵育24小时，细胞内葡萄糖消耗增加，ATP减少，钠离子泵出减少，细胞膨胀脆性增高。参考值未孵育50%溶血4~4.45%孵育50%溶血4.65~5.9%意义脆性增高遗传性球形红细胞增多症脆性减低缺铁性贫血珠蛋白生成障碍性贫血(3)自身溶血试验及其纠正试验•红细胞在37℃孵育48小时，其间由于膜异常引起钠内流倾向明显增加，ATP消耗过多；或糖酵解途径酶缺乏所引起ATP生成不足等原因可导致溶血，称为自身溶血试验。•在孵育时，加入葡萄糖或ATP作为纠正物，观察溶血可否有一定的纠正，称为纠正试验。•正常人轻微溶血，溶血度3.5%；加葡萄糖、ATP溶血明显纠正，溶血度1%。•遗传性球形红细胞增多症和先天性非球形细胞性溶血性贫血的鉴别诊断。临床意义：1、遗传性球形红细胞增多症时，溶血明显增加，加葡萄糖、ATP溶血明显纠正。2、Ⅰ型先天性非球形细胞性HAG6PD缺陷：＋ATP：可纠正但不能纠至正常＋G：同上3、Ⅱ型先天性非球形细胞性HAPK缺陷：＋ATP：可纠正＋G：不纠正（三）红细胞酶缺陷的检测红细胞失去核和线位体，不含糖原，必须从血中吸取葡萄糖以获得能量，红细胞内缺乏完整的有氧氧化酶系统，不能进行有氧氧化。无氧糖酵解（90％）—丙酮酸激酶戊糖旁路途径（5％-10％）—葡萄糖6-磷酸脱氢酶G6PD和PK缺陷•ATP合成减少时，红细胞膜上Na+-K+-ATP酶活性减低，红细胞内钾丧失而钠增加，易在单核-巨噬细胞系统内阻留和破坏。•ATP合成减少，影响膜上钙-活性ATP酶，使钙沉积在细胞膜上，改变膜的柔韧性和变形性，在血循环易于破坏。（1）自身溶血试验及其纠正试验结果：均阳性，即溶血率5%，多者可50%•G6PD缺陷：＋ATP：可纠正但不能纠至正常＋G：同上•PK缺陷：＋ATP：可纠正＋G：不纠正（2）高铁血红蛋白还原试验G6P6-PGA核酸-5-磷酸G-6-PDG-6-PDNADP+NADPHNADP+NADPH•NADPH是高铁血红蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶的辅酶。G6PD缺陷•NADPH减少时，高铁血红蛋白和谷胱甘肽还原下降。参考值：高铁血红蛋白还原率75%高铁血红蛋白0.3-1.3g/LG6PD缺陷—高铁血红蛋白还原率明显下降（3）变性珠蛋白小体生成试验受检RBC＋乙酰苯肼作活体染色（甲基紫）有变性珠蛋白小体，则膜上形成紫黑色颗粒•计算含5个及以上珠蛋白小体的红细胞的百分率•正常人含5个及以上珠蛋白小体的红细胞一般小于30%见图37℃1~2h•G6PD缺乏症常高于45%，故可作为G6PD缺乏的筛检试验。•还原型谷胱甘肽缺乏症也增高。•不稳定血红蛋白病含小体的细胞百分率为75%~84%。•HbH病和化学物质中毒时也增高。（G6PD缺乏症，NADPH减少时，红细胞内还原型谷胱甘肽减少，高铁血红蛋白增高，形成变性珠蛋白小体）HeinzBodyHaemolyticAnaemiaG6PDdeficiencyisthemostcommonenzymopathycausinghereditaryhaemolyticanaemia.咬合形细胞、盔形红细胞水泡细胞BlistercellHeinzbodiesG6P6-PGA核酸-5-磷酸G-6-PDG-6-PDNADP+NADPHNADP+NADPH•NADPH在紫外线照射下会发出荧光•NADPH的吸收峰在波长340nm处，可通过单位时间生成的NADPH的量来测定G-6-PD活性。•正常人有很强荧光,酶活性为（4.97±1.43）U/gHb•G-6-PD缺陷者荧光很弱或无荧光•杂合子或某些G-6-PD变异者则可能有轻到中度荧光(4)G6PD荧光斑点试验和活性测定(5)PK荧光斑点试验和活性测定•标记荧光于NADH上，此时有荧光的NADH变为无荧光的NAD•正常人PK活性斑点在20钟内消失,酶活性15.1±1.99U/gHb•荧光斑点不消失或时间延长说明PK活性缺乏•中间缺乏（杂合子）时，荧光25min~60min消失•严重缺乏（纯合子）时，荧光60min不消失。PEPPKADPATP丙酮酸LDNADHNAD乳酸（四）珠蛋白合成异常的试验•血红蛋白由珠蛋白和血红素构成，珠蛋白分子由两对肽链组成，一对是α链，另一对是非α链（β、γ、δ），正常成人血红蛋白有3种：HbA(α2β2)、HbA2(α2δ2)、HbF(α2γ2)。•珠蛋白异常分为两大类，一类是某个肽链合成量减少，即地中海贫血（αβ），另一类是多肽链的结构发生质的改变，即异常血红蛋白病。（1）血红蛋白电泳检测：醋酸纤维膜电泳法，检查有无异常血红蛋白区带诊断海洋性贫血地中海贫血异常HB带+—醋酸纤维蛋白膜电泳临床意义：①HbA2↑：β-地中海贫血。恶贫、巨贫轻度↑。②HbA2↓：缺铁、铁粒幼红细胞贫血。（2）胎儿HB酸洗脱试验HbF抗酸能力较强，不易被酸洗脱。血片置酸性缓冲液保湿一定时间。含HbF的红细胞不被洗脱，再用伊红染色呈鲜红色成人1%，地中海贫血轻型少数RBC呈阳性，重型阳性RBC明显增多。（3）胎儿血红蛋白测定或HbF碱变性试验在碱性溶液中，HbF不易变性沉淀，其他Hb在碱性溶液中易变性沉淀，测定滤液中Hb含量，即HbF含量。成人2%，新生儿55~85%,1岁左右同成人增高：β地中海贫血明显（80~90%）。急性白血病、再障、红白血病、淋巴瘤轻度↑。（4）HbA2定量测定：1.1~3.2%临床意义同Hb电泳（5）限制性内切酶谱分析：意义：Hb病的基因诊断。（五）自身免疫性溶血性贫血检测autoimmunehemolyticanemiaAIHA自身免疫性溶贫（AIHA）：是体内免疫发生异常，产生自身抗体或（和）补体。结合在RBC膜上，RBC易被单核－巨噬细胞系统所吞噬，RBC破坏加速而引起一组溶血性贫血。（1）抗人球蛋白试验(Coombs)原理直接抗人球蛋白试验：自身免疫性溶血性贫血（AIHA）血清中有抗自身红细胞的不完全抗体，他与表面附有相应抗原的红细胞结合，成为致敏红细胞，加入抗人球蛋白与红细胞表面不完全抗体结合，使红细胞相互连接起来出现凝集现象。来证实红细胞表面有不完全抗体。——抗人球蛋白直接试验阳性；间接抗人球蛋白试验：检查血清中有无游离的不完全抗体，敏感性差。抗人球蛋白IgG不完全抗体RBC直接抗球蛋白试验（DAT）阳性（右）临床意义①正常人抗人球蛋白试验直接、间接均阴性，②自身免疫性溶血性贫血阳性（主要见于温抗体型，在37℃条件下作用最强IgG）,(冷抗体型4℃条件下进行试验IgM)③新生儿同种免疫溶血病、SLE、RA、HD、NHL可阳性。（2）冷凝集素试验原理：冷凝集素是一种可逆性抗体，在低温时可与自身RBC、“O”型RBC或与患者同型RBC发生凝集，当温度升高时，凝集块又复消失。参考值：效价1：40，适合温度4℃。临床意义：某些AIHA病人效价很高（达64000或更高）。（3）冷热双相溶血试验：原理：阵发性寒冷性Hb尿症（PCH）病人血清中有双相溶血素，在0~4℃时，溶血素与RBC结合，并吸附补体，但不溶血；当升高至30~37℃则发生溶血。临床意义：阳性：见于PCH；麻疹、水痘、流行性腮腺炎，传染性单核细胞增多症。（六）阵发性睡眠性Hb尿症检测(paroxysmalnocturnalhemoglobinuriaPNH)PNH是红细胞膜的获得性缺陷引起的对激活补体异常敏感的一种慢性血管内溶血，临床表现以与睡眠有关的、间歇发作的血红蛋白尿为特征，可伴有全血细胞减少或反复血栓形成。（1）酸溶血试验(Ham)原理：红细胞+弱酸血清（pH6.6~6.8）37℃1小时红细胞膜对补体敏感，备解素作用下溶血。临床意义：正常人阴性，阵发性睡眠性血红蛋白尿阳性（PNH）PNH不同时间尿样含铁血黄素Ham试验（2）蔗糖水溶血试验离子浓度低，增强补体与红细胞结合，膜–孔，水进入-细胞破坏原理：蔗糖溶液离子浓度低，经孵育可加强补体与RBC膜的结合，使PNH病人的RBC膜上形成小孔，随之蔗糖进入RBC而导致溶血。PNH阳性，巨贫、再障、AIHA、先天性球形红细胞增多症轻度溶血。筛选试验。（3）蛇毒因子溶血试验眼镜蛇毒中提取的一种蛋白质，它能直接激活血清中的补体C3，通过旁路激活补体，PNH红细胞破碎而引起溶血。特异性PNH试验。流式细胞仪检测CD55和CD59PNH时，红细胞、淋巴细胞、粒细胞和单核细胞的细胞膜上CD55和CD59表达下降。分子生物学方法检测GPI锚连蛋白PNH时，GPI（糖化肌醇磷脂）锚连蛋白缺乏。血浆游离HB检测血红蛋白尿血清结合珠蛋白检测：血浆高铁血红素清蛋白检测：含铁血