分子生物学 许晓东2

2染色体与DNA2.1染色体2.1.1染色体概述染色体(chromosome)是细胞核中载有遗传信息的物质，在显微镜下呈丝状或棒状，由核酸和蛋白质组成，在细胞发生有丝分裂时期容易被碱性染料着色，因此而得名。同一物种内每条染色体所带DNA的量是一定的，但不同染色体或不同种中间变化很大。原核细胞染色体外裹着稀疏的蛋白质，其中一部分与DNA的折叠有关，另一些则参与DNA复制、重组及转录过程。真核细胞的染色体中，DNA与蛋白质完全融合在一起，其蛋白质与相应DNA的质量比约为2:1。此外还有少量RNA。人类染色体显微结构图19Mb210genes240Mb3453genesDNA的分布主要在染色体上细胞质内细胞核遗传细胞质遗传生物的遗传例：紫茉莉叶色的遗传•在分子生物学中，我们用“染色体DNA”，是为了区别质粒、线粒体和叶绿体DNA。•了解染色体，是为了了解DNA的存在状态，同时也是为了理解染色体水平的基因表达调控。•染色体本身也是分子生物学家的研究材料，比如针对端粒的研究。2.1.2真核细胞染色体的组成•染色体作为遗传物质的特征：分子相对稳定；能自我复制，保持遗传连续性；能指导蛋白质合成，控制生命过程；能产生可遗传的变异。•化学组成–(1).DNA：约占30%，每条染色体一个双链DNA分子•是遗传信息的载体，也就是所谓的遗传物质–(2).蛋白质•组蛋白(histone)：呈碱性，结构稳定；与DNA结合形成、维持染色质结构，与DNA含量呈一定的比例•非组蛋白：种类和含量不稳定；作用还不完全清楚，可能与染色质结构调节有关，在DNA遗传信息的表达中有重要作用–(3).少量的RNA（含量小于DNA含量的10%）1.蛋白质包括组蛋白（Histone）和非组蛋白。富含赖氨酸和精氨酸HistonewereanalyzedbySDS-PAGE•组蛋白的特性1.进化上的极端保守性特别是H3、H4，牛、猪、大鼠的H4完全相同，牛和豌豆的H4只有两个氨基酸的差异。2.无组织特异性仅发现两个例外（鸟鱼两栖红细胞H1-H5，精细胞鱼精蛋白）3.肽链上氨基酸分布的不对称性N端碱性氨基酸C端疏水氨基酸4.组蛋白的修饰作用甲基化、乙酰化、磷酸化、ADP核糖基化等5.富含赖氨酸的组蛋白H5只存在于鸟类、两栖类等含有细胞核的红细胞中肽链上氨基酸分布的不对称性N端碱性氨基酸C端疏水氨基酸组蛋白的修饰作用——影响组蛋白与DNA的亲和性，调控基因表达。Sitesofpost-translationalmodificationsonthehistonetails.Themodificationsshownincludeacetylation(purple),methylation(red),phosphorylation(green),andubiquitination(orange).——Genes&Dev.2001.15:2343-2360•非组蛋白（含量约为组蛋白的60-70%）包括酶类和细胞分裂有关的蛋白（收缩蛋白、骨架蛋白、核孔复合物蛋白、肌动蛋白、肌球蛋白、微管蛋白、原肌蛋白）(1)高速泳动蛋白（highmobilitygroupprotein,HMG蛋白）能与DNA结合，也能与H1作用，可能与超螺旋结构有关。(2)DNA结合蛋白可能是一些与DNA复制或转录有关的酶或调解物质。(3)A24非组蛋白C端与H2A相同，功能不详2.真核生物基因组DNA特点：含有大量的重复序列；功能DNA序列大多被非功能DNA隔开。C值(Cvalue)：一种生物单倍体基因组DNA的总量。C值反常现象(C-valueparadox)：C值往往与种系进化的复杂程度不一致。不重复序列一个或几个拷贝，占DNA总量的40-80%，序列长约750-2000bp.单拷贝基因也可以合成大量蛋白：蚕丝心蛋白DNA—104mRNA—109protein中度重复序列重复次数10-104，占DNA总量的10-40%，编码rRNA、tRNA和某些结构蛋白。高度重复序列卫星DNA(satelliteDNA)，占基因组的10-60%，由6-100个碱基组成，大多位于染色体着丝粒，功能不明，可能与染色体的稳定性有关。卫星DNA(satelliteDNA)3.染色质和核小体(Chromatinandnucleosomes)染色质DNA的Tm值比自由DNA高。染色质DNA的复制和转录活性比自由DNA低。DNA酶I(DNaseI)对染色质DNA的消化慢于纯DNA。延伸Tm值:DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度核小体(nucleosome)是一种串珠状结构，由核心颗粒和连结线DNA两部分组成，可描述如下：①每个核小体单位包括约200bp的DNA、一个组蛋白核心和一个H1；②由H2A、H2B、H3、H4各两分子形成八聚体，构成核心颗粒；③DNA分子以左手螺旋缠绕在核心颗粒表面，每圈80bp，共1.75圈，约146bp，两端被H1锁合；④相邻核心颗粒之间为一段60bp的连接线DNA。ShorterlinkerDNAfavorLongerlinkerDNAfavor用小球菌核酸酶(Micrococcusnuclease)消化染色质DNAJBCApril27,2007vol.282no.1712537-12546核小体单体被微球菌核酸酶处理后，随着时间延长，其降解产物(DNA片段)会逐渐缩短，从200bp降至146bp，至此很难再进一步降解。这种稳定结构为核心颗粒，它是由146bp的DNA片段和H2A、H2B、H3和H4各2分子组成。从DNA到染色体染色体结构的矛盾及协调•DNA与组蛋白及其它包装蛋白的结合降低了其可接近的能力。•这种可接近能力的降低会影响介导DNA复制、修复、转录和重组的蛋白与DNA间的接近和相互作用。•解决压缩DNA和接近DNA的矛盾就是如何调控染色质的结构.•研究已表明，单个核小体的结构变化可允许染色体该区域的DNA与其它蛋白相互作用。•核小体的结构变化可由修饰和重建核小体的酶所介导。因此，了解核小体的结构及其变化调控是解释真核细胞DNA复制、重组、转录等过程的关键。•Certainstainingtechniquescausethechromosomestohavetheappearanceofaseriesofstriations,whicharecalledG-bands.•ThebandsarelowerinG-Ccontentthantheinterbands.•GenesareconcentratedintheG-C-richinterbands.ThehumanXchromosomecanbedividedintodistinctregionsbyitsbandingpattern扩展：ChromosomesHaveBandingPatterns果蝇(Drosophila)染色体结构图通过染色体形态，可以研究基因缺失、重复和倒置。PhotocourtesyofJoséBonner,IndianaUniversityThepolytenechromosomesofD.melanogasterformanalternatingseriesofbandsandinterbandsIndividualbandscontainingparticulargenescanbeidentifiedbyinsituhybridizationPolyteneChromosomesFormBands真核生物基因组的结构特点1.基因组庞大2.存在大量重复序列3.大部分为非编码序列（90%）4.转录产物为单顺反子(见下页解释)5.真核基因是断裂基因，有内含子6.存在大量顺式作用元件（启动子、增强子、沉默子）7.存在大量的DNA多态性8.有端粒结构相对同一染色体或DNA分子而言为“顺式”（cis）；对不同染色体或DNA分子而言为“反式”（trans）。延伸：什么是顺反子(cistron)2.1.3原核生物基因组1结构简练绝大部分编码蛋白质2存在转录单元功能相关的基因往往集中在一起，它们可被一起转录成多顺反子mRNA3有重叠基因阅读框改变或不改变重叠基因OverlappinggenesBMCGenomics2008,9:1692.2DNA的结构2.2.1DNA的一级结构DNA（脱氧核糖核酸deoxyribonucleicacid）的组成成分：核糖和脱氧核糖嘌呤(purine)嘧啶(pyrimidine)多聚核苷酸链中新生磷酸糖苷键的产生•DNA的方向是5’-3’（蛋白质是N-C）•DNA通常以线性或环状形式存在•DNA通常是双链的(dsDNA)，少数是单链的(ssDNA)DNA的一级结构是指4种核苷酸的排列顺序。GC丰富区易形成左手螺旋反向重复的片段易形成发夹结构一级结构对高级结构的影响：延伸：5‘TCTCTCTCTCTCTAGAGAGAGAGAGA’33‘AGAGAGAGAGAGATCTCTCTCTCTCT’55‘NNNGAAGGTCCNNNNGGACGTTCNNN’33‘NNNCTTGCAGGNNNNCCTGCAAGNNN’5反向重复序列（invertedrepeatsequence）回文结构（Palindrome）NNNNCGCGTAGCGCATATGCNNNNNN2.2.2DNA的二级结构DNA的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。碱基间形成的氢键B-DNA的反向平行双螺旋结构克里克的草图大沟通常是蛋白质与DNA相互作用的部位……Transcriptionactivator-likeeffectornucleases(TALENs)areartificialrestrictionenzymesgeneratedbyfusingaTALeffectorDNAbindingdomaintoaDNAcleavagedomain.•DNA缠绕在组蛋白上……B构象：生物体内天然存在的DNA几乎都以B-DNA存在。A构象：是在以钠、钾或铯作为反向离子时，将DNA纤维在75%相对湿度下进行X光衍射测定出来的。DNA-RNA杂交分子、RNA-RNA双链结构均为A构象。Z构象：在DNA进行转录或其他一些生理过程中会产生Z-DNA结构，之后DNA会放出能量，形成B-DNA。GC含量高的区域易于形成Z构象。右手螺旋：A-DNA,B-DNA左手螺旋：Z-DNA•Z－DNA的生物学意义：应当指出Z－DNA的形成通常在热力学上是不利的。因为Z-DNA中带负电荷的磷酸根距离太近了，这会产生静电排斥。但是，DNA链的局部不稳定区的存在就成为潜在的解链位点。此外，DNA螺旋上沟的特征在其信息表达过程中起关键作用。Z-DNA中大沟消失，小沟狭而深，使调控蛋白识别方式也发生变化。这些都暗示Z-DNA的存在不仅仅是由于DNA中出现嘌呤-啶嘧交替排列之结果，也一定是在漫漫的进化长河中对DNA序列与结构不断调整与筛选的结果，有其内在而深刻的含意，只是人们还未充分认识而已。•扩展：其他结构Hollidayjunction由重复排列的端粒构成的脱氧核糖核酸四联体结构形态DNA双链的变性与复性加热、提高pH、降低离子强度，都能使DNA双链变性。反之，变性的DNA又可以复性。G+C含量、离子强度和DNA的均一性都会影响变性曲线。2.2.3DNA的高级结构DNA的高级结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。1965年Vinograd等用电镜发现SV40和多瘤病毒的环形DNA的超螺旋。负超螺旋松弛DNA正超螺旋拓扑异构酶拓扑异构酶supercoiledlinearopencircularTopoisomeraseL=T+WL(linkingnumber)：环形DNA分子两条链间交叉的次数T(twistingnumber)：盘绕数W(writhingnumber)：超螺旋数•对于真核生物来说，虽然其染色体多为线形分子但其DNA均与蛋白质相结合，两个结合点之间的DNA形成一个突环(loop)结构，类