第九章工业色谱分离技术

第九章:工业色谱技术(Chromatographyseparationinindustry)第九章:工业色谱技术(Chromatographyseparationinindustry)•9.1:色谱分离技术的分类及一般原理•9.1.1:概念、分类和原理•色谱分离技术:•利用混合液中各种组分之间的理化性质差别,在固定相和流动作相对运动时,由于固定相对组分的作用,不同的组分在两相中被反复多次地分配,形成特有的区段,从而得到分离。–固定相对组分的不同作用包括:•吸附,•分配,•离子交换,•亲和吸附,•凝胶过滤,•以及聚焦作用等.•色谱的概念:•1903年,俄国植物学家茨维特用菊根粉柱和碳酸钙柱分离和研究植物色素提取物,用石油醚提取过柱，在柱上得到黄色和绿色的区带,这便是色谱的最初概念。•随着检测系统的发展和完善,一些无颜色的成分也可以通过仪器检测,因此色谱分离的概念也就广义化.•广义色谱的概念是指组分（包括有色和无色）在载体上的聚集排列而形成的特定区带。•近年来,色谱技术发展很快，显著的特点:–是作为固定相的填料如吸附柱,离子交换柱、亲和柱、凝胶柱等,在种类和型号上日益增多,分离性能越来越好，–另一个特点是与之相配套的检测系统日趋完善,如紫外可见光吸收分光光度计、荧光仪、高效液相色谱仪的配套使用,使此种技术的分离效率、在线检测和检测自动化方面都有长足的进展。–分离技术的应用范围不断扩大，不但应用于小分子的分离，对生物大分子的分离也在不断地得到应用和推广。–色谱反应器(chromatographyreactor)。•色谱技术按其分离过程的原理不同可分为:–吸附色谱(adsorptionchromatography):•吸附色谱分离技术是指混合物随流动相通过吸附剂(固定相)时,由于吸附剂对不同物质具有不同的吸附力而使混合物组分分离,这是最早期的一种色谱分离技术,如氧化铝柱,硅胶柱等–离子交换色谱(ionexchangechromatography)、•离子交换色谱是利用混合液中的离子与固定相中具有相同电荷离子的交换作用而进行.分离的技术。特点：–1、吸附的选择性高，根据待分离组分的带电性、化合价和电离程度，选择合适的离子交换树脂可以从很稀的混合溶液中将待分离的组分进行分离和浓缩。–2、适应性强。从分析分离到工业制备分离，小分子到生物大分子，实验室到工业生产，水的预处理到产品的分离.–3、多相操作，分离容易。通过对树脂进行转型后可反复使用。–亲和色谱(affinitychromatography):•利用生物对之间可逆亲合力结合的特性，如蛋白质和辅酶,抗原和抗体、激素及其受体等,在色谱柱上进行分离的技术称为亲和色谱分离。利用生物分子对的这种特性可以分离和纯化的物质包括酶、蛋白质、酶的抑制剂、抗体和抗原、激素和药物受体、核酸、基因、细胞等等。–凝胶色谱(凝胶过滤，gelchromatography,gelfiltration,gelosmosis):•当混合物随流动相经过固定相(凝胶)时,混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术,作为固定相的凝胶,起着一种过滤分子的筛子一样,分子量大的组分先流出，而分子量小的组分后流出，因此此种技术又被称为分子筛或凝胶过滤。常常被应用于进行分子量的测定、酶、蛋白质、多糖、核酸的分离和提纯。–分配色谱((partitionchromatography):•利用待分离物(溶质)在流动相和固定相溶解度不同而实现分离的技术，叫分配色谱。主要在气－液色谱或液－液色谱系统中实现。对液－液色谱而言，一般地说，流动相的极性比固定相要小。比如用吸附在硅胶上的水作固定相，用氯仿作流动分离乙酰化的氨基酸。如果把这个关系颠倒过来，用极性强的液体作流动相。则称为反相分配色谱(reversephasechromatography,)。比如把某种萃取剂附于一定支持物上，用水溶液作流动相分离金属离子就是反相分配色谱的一种.–聚焦色谱技术(chromato-focusing)。•利用具有两性电解质特点的组分氨基酸、蛋白质、酶等在等电点上的差异,当混合物流经具有pH梯度的固定相时,各组分在相应的等电点上进行聚焦而得以分离的技术。分辨率极高，但由于其处理量少而目前还较难应用于大规模的工业上，通常是作为分析手段对两性电解质进行等电点测定。GeneralizedDiagramofLiquidChromatograph•9.1.2:色谱分离技术的适用性:•色谱技术,其应用包括实验室分析以及大规模的工业分离两个方面。•真正规模较大的工业应用还只是近一、二十年的事情,但从理论上说,所有的色谱技术都可应用于工业上的分离。问题的关键在于:–要解决分离效率随色谱柱的放大而急剧下降的问题,–同时还要解决操作过程的效率问题.最初的色谱分离技术只适用于生物小分子的分离分析。其中氨基酸、核苷酸、有机酸等一些离子化合物多用离子交换色谱,而生物碱、萜类、苷类、糖类、色素等次生代谢小分子则多采用吸附色谱法或反相色谱法分离。自六十年代以后,发展了生物大分子的色谱分离法,包括：多糖基离子交换色谱法和大孔树脂离子交换色谱法，凝胶色谱法，亲和色谱法，聚焦色谱法.虽然根据分子的大小和某些化学性质的差异可分别选择不同的色谱法,但这并不意味着某一色谱方法只适用于某一类物质,而只能说明某一类成分较好地适用于某一色谱法,或者用某种色谱法分离某种物质效果更佳。生物大分子与生物小分子的色谱分离存在一定程度上的差异:1、生物大分子要求固相载体具有亲水性,并具有一定的三维空间结构及疏散度,使生物大分子易于接近和出入固定相部分,从而利用其性质差异而达到分离。2、生物大分子色谱分离时,所选用的固相载体应有利于生物大分子的生理活性的稳定。3、生物大分子的色谱分离条件要求比较温和,一切强酸、强碱、高压和高温都不适宜。•9.2.1:分配平衡及分配平衡常数:•一种溶质在色谱系统中的固定相和流动相间达成平衡的热力学条件是溶质在固定相的化学位µs和它在流动相的化学位µm相等:9.2:色谱分离的一些基本理论•各种色谱方法中，K的表示方法略有不同，对于分配色谱，K称为分配系数K＝单位体积固定相中溶质的量／单位体积流动相中溶质的量•对于以固体固定相的其他色谱，K表示为：K＝1g固定相中溶质的量／1ml流动相中溶质的量•或者：K＝1cm2固定相中溶质的量／1ml流动相中溶质的量,•描述溶质分配特性的另一个重要参数是分配容量K´，或称容量因子，容量比：K´=溶质在固定相中的量／溶质在流动相中的量=ns/nm•或：K´=CsVs/CmVm=KVs/Vm•式中ns，nm为溶质在固定相和流动相的量，Vs，Vm分别为两相的体积。对于吸附色谱，Vs可用吸附剂表面积表示；在离子交换色谱中，Vs可用交换剂的重量或交换剂容量来表示；在凝胶色谱中则用凝胶的孔容表示。••分配容量K´是描述溶质在两相分布的简便形式，它不仅与两相性质有关，还与温度、色谱床结构有关，但与流动相流速及柱长无关。•色谱系统中流动相体积与固定相体积之比用表示，称为相比：=色层柱内流动相体积／色层柱内固定相体积＝Vm/Vs9.2.2:分配等温线•在恒定温度下，将cs对cm作图，所得关系曲线称分配等温线。对吸附色谱，也称吸附等温线。等温线有三种类型：–一类为线性等温线，分配系数与溶质浓度无关，能够获得对称的色谱峰，溶质的保留时间不随浓度而变化，分配色谱大多属这种类型；–另外两类是非线性等温线。•若等温线呈凸型，则会导致出现拖尾的色谱峰，保留时间随样品量的增大而减小，吸附色谱多属这种情况；•若等温线为凹型，则导致出现前伸色谱峰，随着样品量的增加，保留时间亦增加，减少样品量有可能获得对称的色谱峰。••凸型等温线造成拖尾现象的原因：–凸型等温线表示溶质浓度低时被吸附得牢，浓度高时吸附相对减弱。色谱峰中心部位溶质浓度较高，前沿浓度较低，前沿部分由于吸附较牢，淋洗时向前移动较慢，中心部位由于吸附较弱而相对提前，所以流出峰前沿陡直，后沿由于浓度低而迟迟不被洗出，于是造成拖尾。•凹型等温线的情况则正好相反。•不管是凸型线还是凹型线，在起始部分都可近似看作直线，这就是说，在样品量很小时，都近于线性。在各种灵敏的分析用色层中，进样量小这一点不难做到，常可以得到很好的淋洗峰。对于处理量大的制备色层，淋洗峰的前伸和拖尾往往会造成一些麻烦。9.2.3:色谱图•混合液中在经过一个色谱层析柱后,在对组分进行洗脱时，以流出组分的洗脱时间或洗脱体积作横坐标，以分离组分的浓度或相应的检测信号为纵坐标作图，便形成峰形的浓度分布,称为色谱。•多个组分流过色层柱后,形成连续出现的多处色谱峰,这些色谱峰构成的图形称为色谱图。•任何一种色谱分离技术在分离过程中都会出现此种现象。色谱图中包含如下几个基本概念或信息：–1：基线，指当没有样品进入检测器时，检测器给出不变的信号。图中以OD表示。–2：峰高，即色谱峰的顶点到基线的垂直踞离，图中以AB和h表示。–3：，标准偏差，为与0.6070倍峰高相对应色谱峰宽度的一半。即图中EF的一半。–4：半峰宽度，即峰高一半处的宽度，即图中的GH。–5：峰底宽，由色谱峰两边拐点作切线，与基线相交，两交点间的踞离即是峰底宽。如图中的W。–6：峰面积：即色谱峰曲线所形成的面积，如图中的CBD。–7：死时间t0(deadtime):溶质从进入柱到流出柱，处在流动相的时间就是死时间.–8：保留时间tR(retainedtime):进样后到最大出样量的时间(峰值出现的时间）.•这些基本概念是进行色谱计算的基础。色谱图是色谱分离的重要理论依据。因为色谱图可以给我们提供如下的几个重要信息：–（1）:跟据峰的多少可以判断样品是否为纯化合物。出现多少个峰起码就有多少个这些峰所代表的组分。–（2）:说明分离情况,评价色谱柱对性质相近的组分间的分离度。亦即分辨率。峰之间分得越开，分离情况就越好。–（3）:提供组分出现的时间和体积数据。跟据这些数据可对组分进行适当的收集和分离。–（4）:根据峰高和峰面积进行定量计算。•9.2.3.1:保留值:保留值用保留时间或保留体积表示，反映溶质与固定相作用力的大小。•9.2.3.2:比移值：Rf•Rf=溶质谱带平均移动速度(ux)/流动相平均速度(u)•比移值在平板色谱中用作定性分析的依据，在柱色层中也表征保留行为。在色谱系统中溶质不断在流动相和固定相间转移，从统计可知，一个溶质分子在流动相中停留的时间分数，等于溶质在流动相中的分数，而溶质在流动相停留的时间分数就是ux/u。如果溶质在流动相中的分子数为nm，在固定相的分子数为ns，则：•当nm＝0时，表示全部溶质都在固定相，它当然不会移动，ux＝0，Rf＝0；•当ns＝0时，全部溶质都在流动相，它会同流动相一起移动。ux＝u，Rf＝l。也不能实现分离，一般情况下，0＜ux＜u，•0＜Rf＜1。•比移值Rf还与分配容量K´有关，K´=ns/nmK´=CsVs/CmVm=KVs/Vm•9.2.3.3:保留时间•以L表示柱长，以u表示流动相平均线速度，定义死时间（溶质从进入柱到流出柱，处在流动相的时间就是死时间）t0为：这个时间可以用基本上不与固定相作用的溶质通过柱的时间来测定。保留时间tR（进样后到最大出样量的时间）定义为：t0=L/utR=L/uxux：溶质谱带平均移动速度。由上述两式消去L，t0u=tRux，ux/u=t0/tR,又：ux/u=1/(1+k´),K´=KVs/Vm所以有：保留时间tR在t0和一个较大值间变动，它取决于色谱过程的热力学因素，在一定的体系和操作条件下，对某一化合物为确定值，这是色谱法定性分析的依据。定义校正保留时间tR´为保留时间与死时间之差：•追踪一个溶质分子，它一部分时间在流动相，与流动相有相同的前进速度；另一部分时间在固定相，前进速度为0。溶质从进入柱到流出柱，处在流动相的时间就是死时间t0，其余时间被固定相滞留。因此，tR´反映了溶质滞留在固定相的时间，是各组分产生差速迁移的根据。由式tR´=tR-t0转变可得：•9.2.3.4:分配容量:分配容量k