6.放射性核素示踪技术

第六章放射性核素示踪技术放射核素示踪技术是利用放射性核素及其标记化合物作为示踪剂，应用射线探测方法来检测它的行踪，以研究示踪剂在生物体系或外界环境中运动规律的核技术。放射核素示踪技术是实验核医学中最重要的实验核技术之一，促进了学科的交叉和渗透，贯穿于整个核医学中，也被经常应用于基础医学、临床医学等各个学科。§1放射性核素示踪技术的原理及特点一、基本原理放射性核素示踪实验的原理基于两个方面：1、相同性：即放射性核素及其标记化合物和相应的非标记化合物具有相同的化学及生物学性质，在生物体内的变化相同；2、可测量性：即放射性核素能发出各种不同的射线，可被放射性探测仪器所测定或被感光材料所记录。二、主要特点1.灵敏度高：灵敏度可达10-14～10-18g水平，因而对研究体内或体外实验系统内的微量物质具有特别重要的价值。2.检测方法简便。3.合乎生理条件：引入高比放射性示踪剂，不会改变体内或体外系统的正常生理平衡，实验结果接近正常生理状态物质的变化。4.能定位和定性。比如利用RAG可检测示踪剂在组织、细胞内的分布情况等。三、基本类型、方法及注意事项(一)类型：1.整体示踪实验：将标记物引入完整的机体，从体外或取标本观察标记物的去向，以了解示踪剂在机体内的运动规律，主要用于研究物质在体内的吸收，分布、代谢和排泄过程。2.离体示踪实验：指从整体中分离出来的组织或细胞等简单系统进行的实验。多用于某些特定物质如蛋白质、核酸等的转化规律以及某些精细结构的功能研究。3.双标记示踪实验：其原理就是将两个研究对象包括两种分子或是一种分子的两种形态或是一种分子的两个部分，分别带上示踪原子，通过采用相应的测量方法，分析两种标记原子的量，观察它们经过运动转化前后比值的变化，判断该两种观察对象的运转规律。(二)实验方法及应注意的问题1、标记物的选择：①射线类型：体内示踪实验宜选用γ射线发射体，如131I、99mTc；离体示踪或取样进行离体测定的研究则多选用β射线或低能γ射线发射体，如3H、14C及125I等。②半衰期：体内示踪实验一般选用短半衰期核素，体外示踪实验可用半衰期长的放射性核素。③放化纯度：必须经过纯化鉴定、放化纯度95%。④比活度：根据示踪实验灵敏度要求选择适当的比活度，整体示踪实验时，标记物的引入基本不改变该物质的体内含量，同时要求能经得起体内的稀释，使放射性测量的统计误差在允许范围内。⑤标记位置的选择：物质转化的示踪研究要求采用定位标记示踪物，而目标记物在代谢过程中应稳定、不脱落。当研究的目的只是观察标记物的去向，而不管其代谢产物，就不需要严格定位的标记物。2、选择合适的测量方法：通常根据选用的核素发射的射线种类确定用何种方法测量。如固体闪烁测量，液体闪烁测量、放射自显影等方法。双标记要用双标记方法测量。3、示踪剂量的估算示踪剂量的估算不能用简单的公式来估算，应该综合考虑。①稀释作用：放射性核素标记化合物进入机体后，一般要求放射性活度在整个实验过程中，经稀释后所制得的放射性样品不能低于本底计数。②组织的浓聚作用：由于某些放射性核素有亲某种组织的特性，有的放射性核素进入机体后不是完全均匀被稀释，而可能选择性地蓄积到某些器官、组织而浓聚。如131I进入体内后，有30%或更高可被甲状腺摄取，给予剂量时就要考虑这个特异性。③实验周期及安全剂量：根据试验周期长短，实验分析方法，给予途径等进行安全剂量估算。4、示踪剂引入途径：根据实验类型和目的，对整体动物实验可采用静脉、腹腔、皮下及肌肉注射，或口服、灌胃等。5、放射性样品的制备：样品的制备是为测量服务的，测量的形式主要有三类：①取标本在体外测放射性；②制成不同水平的切片作放射自显影；③从体外测整体内的放射性。因此样品制备就要适应不同测量类型。6、数据处理：放射性示踪实验结果可根据不同目的选用不同参数表示，含义也各不相同，概括为以下几种。①整个脏器的总放射性活度：主要用于研究物质分布的实验以反映各脏器的相对分布量。②放射性含量：dpm/mg组织或ml体液、dpm/mg蛋白或DNA等。用以反映不同组织浓集某种物质的能力。③比活度：dpm/mmol或mg化合物。主要用于研究内源性物质的动态分布或代谢。④相对比活度：两个解剖部位中同一化合物比活度的比值或两种化合物比活度的比值。用于反映组织中某物质的来源及组织与血液交换的速率，可排除血液中比活度不恒定的影响。四、示踪实验中的同位素效应物质转化时，如分子中某一原子被它的同位素所取代，虽然反应性质不变，有时却会发生反应速度的改变，称为同位素效应(isotopeeffect)。在作物质动力学研究时，应考虑同位素效应。§2放射性核素稀释法一、概念放射性核素稀释法(radionuclidedilutiontechnique)即用适当的放射性核素标记化合物作为示踪剂，利用化学上的稀释原理对微量物质作定量分析，或测定液体容量的方法。二、基本原理依据化学物质在稀释前后质量不变的原理，放射性物质在被稀释前后，其放射性活度也不会改变。但是，由于被稀释，它的比活度或放射性浓度降低了。设质量为m1的标记物的比活度为s1与质量为m2的同一种化学形态的非示记物均匀混合，则标记物被非标记分子所稀释，混合物的比活度为s2，混合前后的总放射性应相等。即：s2(m1+m2)=s1m1如果m1和m2中有一个量为已知，只需测定混匀后样品(取任意量)的比活度，就可算出另一量。三、基本方法(一)核素正稀释法(directnuclidedilution)用已知量的标记物测定未知量的非标记物的稀释法称为核素正稀释法。方法要点是：将一定量已知比放射性的标记化合物与其非标记化合物的分子均匀混合，测定该混合样品的比放射性，亦可进行提纯后测定该样品的比放射性。根据比放射性的降低来计算非标记化合物的含量。设：m1为标记化合物的量；A为标记化合物的放射性；S1为标记化合物的比活度；S2为稀释后混合液的比活度；mx为样品中待测化合物的量根据公式S2(m1+m2)=S1m1得：mx=m·(S1/S2-1)这是正稀释法的基本公式。例题：某样品内含有微量磷酸钠(Na3PO4)，加32P标记的磷酸钠(Na332PO4)0.05mg，其放射性计数为1950cpm，混匀后分离得纯品磷酸钠0.1mg，放射性计数为600cpm，求样品中磷酸钠的含量。解：已知A=1950cpm,m1=0.05mg,S1=1950/0.05=39000(cpm/mg)S2=600/0.1=6000cpm/mg,代入基本公式得：mx=0.05×(39000÷6000-1)=0.275mg(二)核素反稀释法(inversenuclidedilution)：用已知量的非标记物测定样品中标记物含量的方法称之为核素反稀释法。反稀释法与正稀释法测定的原理相同，可以用同样的公式计算，只是选择的未知数不同，反稀释法的测定对象是求标记物的化学量m1。四、放射性核素稀释法的应用放射性核素稀释法当初建立时，曾大量用于体外样品的定量工作。但自从灵敏度更高的放射免疫分析方法及由此发展起来的非放射性分析方法推广以来，现已较少使用。但是在某些领域，核素稀释法仍有不可取代的优越性。一是测定生理性物质的体内代谢库或测定整体内各种体液成分的量，二是作为考核其它超微量分析方法可靠性的参比。1、测定生理性物质的体内代谢库：体内各种生理性物质都有各自的分布范围，每个分布范围称为一个代谢库。利用同位素稀释法来测定活体各代谢库的大小几乎是绝大多数物质整体代谢库的唯一有效方法。例如静脉注射少量高比活度的3H-胆酸，待其在包括血浆在内的代谢库混匀后取样测比活度，按稀释法原理即可算出体内包括血浆在内的胆酸代谢库的大小。2、整体内各种体液成分的量整体内有些体液成分的量相对恒定，它们不一定是一种特定物质，因此习惯上不称为代谢库，但是它们的变化有理论意义和临床实践意义。测量它们总量的唯一办法也是同位素稀释法。下表是常用的几种体液成分测量法。§3物质转化的示踪研究研究物质转化的目的要揭示机体内重要生命物质的前身物、中间物、及产物的关系，以完成某种转化的必要条件。该方法是目前最常用最理想的方法之一，可以在整体、离体的条件下进行进行，不但能够对前身物、中间物，产物作用定性分析，还可用来研究前身物转化为产物的速度，转化的条件，转化的机制及各种因素对转化的影响等。一、掺入实验(incorporationexperiment)(一)基本原理：要研究生物体系中化合物A和B是不是前身物和产物的关系，可将A的适当部位用放射性核素标记。进入生物体系(整体或离体组织)后一定时间，分离出B。如在B中出现较多的标记核素，说明A的标记原子、标记集团或整个标记分子已参入到B中，即证明化合物A是产物B的前身物。(二)主要参数：1、掺入百分率(incorporationpercentrate)，表示引入的前身物分子能转变为产物的百分率，即掺入百分率=产物的总放射性/前身物的总放射性×100%上式中产物的总放射性并不反映前身物转化为产物的总量，这是因为标记前身物进入生物体系后往往被内源性前身物所稀释，而后者形成的产物不带放射性，因此，形成的非放射性产物越多，产物的总放射性反而越低。2、相对比活度(relativespecificactivity)常用比活度来表示产物和前身物各自的放射性，即毫(微)克分子的放射性，然后再计算它们的比值来反映它们的相互关系，这种关系就称为相对比活度，相对比活度=产物的比活度/前身物的比活度。式中的前身物比活度是指标记前身物与内源性前身物混匀后的测定值，两者应同时测量。相对比活度反映的是前身物转化为标记产物的速率，或称为标记前身物的利用率，即掺入率(incorporationrate)。(三)掺入实验的类型1、整体(invivo)掺入实验：多数采用实验动物，选用适当的标记物也可在人体内进行。整体实验有利于观察某一物质在体内转化的全貌，某些酶系统作用的研究有时只能在整体进行。如果实验设计合理，整体参入易于得出最后结论。但由于体内有循环交换及代谢旁路，不易弄清转化过程的细节。2、离体(invitro)参入实验：研究物质转化过程的细节常采用离体参入实验，实验条件易于控制，有利于在分子水平阐明转化过程的具体步骤，转化条件及影响因素。一般用于离体掺入实验的生物材料主要有组织切片、组织匀浆、游离细胞、亚细胞颗粒或无细胞酶系统，要求研究材料保持生理活性，至少在进行实验期间能与引入的标记物相互作用。应用较多的是组织匀浆。(四)基本方法1.选择合适的标记物。根据待测代谢物的特定，选用适当前身物并在一定部位进行标记。2.将标记物引入生物体系。3.分离产物。根据不同情况采用不同的分离方法，提取的产物最好制备成溶液。4.测量产物。放射性测量及物质定量，由此求出比活度。(五)要求与条件1.标记前身物用量是示踪量。要求比活度尽可能高，保证测量结果准确可靠。2.放化纯度要高(95%)。3.分离的产物要求达到放化纯。（六）掺入实验实例以淋巴细胞转化实验为例对这类方法作简单介绍。人外周血T淋巴细胞在PHA（植物血球凝集素）的刺激下发生母细胞转化而增殖，处于S期的细胞不断地摄取TdR（胸腺嘧啶核苷，DNA合成的前身物）用以合成DNA。与此同时，3H-TdR也不断地被摄入细胞内而被放射性标记。通过液闪计数测量，可了解淋巴细胞增殖活动的情况，借以了解机体的细胞免疫功能。如果用于肿瘤细胞研究，可以反映活动周期肿瘤细胞的数量或细胞的增殖活力，对研究肿瘤的发生、发展，疗效观察及预后判断具有重要的意义。常用结果的表现形式：3H-TdR掺入百分率、刺激指数（刺激组与对照组DNA的放射性之比）。